Développement d’un test robuste et de faible coût d’identification des microvésicules membranaires (MVs), bio-marqueurs du risque cardiovasculaire. La méthode est basée sur la reconnaissance sélective de la phosphatidylsérine (PS) présente à la surface des MVs par des complexes de coordination. Le dénombrement et la caractérisation complète des MVs à des fins de diagnostic précoce permettront une prise en charge plus efficace des patients.
En réponse à différents stimuli (infectieux, inflammation), les cellules sont activées, ce qui se traduit par un remodelage de la membrane cellulaire et la libération de microvésicules (MV). Dans les fluides biologiques, ces MVs, exposant la phosphatidylsérine à leur surface, sont considérées comme des biomarqueurs de l’activation cellulaire étudiés dans de nombreuses pathologies (diabète, hypertension, thrombose, sepsis). Il y a ainsi un réel intérêt à les étudier pour la détection précoce, la prise en charge et le suivi thérapeutique. A ce jour, le manque de techniques pour séparer, conserver, analyser et caractériser les MVs sont des verrous à la compréhension de leurs fonctions. L’objectif de ce projet est le développement d’une nouvelle méthode de capture des microvésicules par des complexes de coordination bimétalliques immobilisés sur une surface grâce à leur capacité de coordination avec la phosphatidylsérine. Après les études des interactions des complexes métalliques avec les phospholipides sous formes de monomères et de vésicules modèles, des essais sur des microvésicules issues d’échantillons biologiques standardisés ont été réalisé pour une application dans des cohortes cliniques
L’approche pluridisciplinaire implique :
1-Les synthèses et caractérisations de nouveaux complexes de zinc et de cuivre capables de reconnaître sélectivement la phosphatidylsérine exposée à la surface des microvésicules
2-La mise en œuvre des complexes pour des études d’interactions (en solution et sur supports) avec des phospholipides agencés dans des structures de complexités croissantes (monomères, vésicules modèles, microvésicules issues d’échantillons biologiques).
3-Le greffage des complexes sur différents supports (supports multi-puits, microbilles fonctionnalisées)
4-En parallèle la culture de cellules stromales mésenchymateuses provenant de différents donneurs sains
5-L’isolement de microvésicules de cellules souches mésenchymateuses stromales et leur caractérisation en tant que référence
6-La mesure standardisée des microvésicules dans les plasmas de patients en utilisant les microvésicules de référence dans les tests fonctionnels
1)Comparaison de la sélectivité de nouveaux complexes de coordination à zinc ou à cuivre pour la phosphatidylsérine (PS)
2)Preuve du concept de la détection des microvésicules (MVs) grâce à l’introduction d’une sonde fluorescente
3)Qualification des banques de cellules stromales mésenchymateuses et des MVs (phénotype et fonctionnalité, taille)
4)Sélection du support d’immobilisation du senseur de PS en microplaque
5)Validation du dosage ultrasensible des MVs chez les transplantés d’îlots pancréatiques comme marqueurs précoces de la perte du greffon et de la séquence d’activation cellulaire
• Nous avons mis en évidence que la fluorescence peut être une méthode de détection à considérer dans le contexte de la détection des microvésicules. C’est pourquoi une des perspectives de ce travail serait d’intégrer d’autres groupements fluorescents pour amplifier les signaux.
• Les études de caractérisation par intérferométrie de biocouches initiées avec le projet ont permis de démontrer la pertinence de cette technique encore récente pour la caractérisation des vésicules extracellulaires. Des essais systématiques devraient encore être réalisés pour en valider son application.
• Ce projet ouvre des perspectives nouvelles dans l’étude de MVs en utilisation clinique par des laboratoires dit de routine qui sont habitués à la réalisation des tests de type ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
Les avancées du projet permettent de qualifier les microvésicules de cellules stromales mésenchymateuses comme une référence pour la détection d'activités enzymatiques, ou des marqueurs antigéniques de MVs dans plusieurs pathologies. La méthode est donc polyvalente et son principe a déjà fait l'objet d'un brevet conjoint CNRS-Université de Grenoble. Des articles sur la méthodologie et ses applications cliniques ont déjà été publiés dans des revues internationales (9) et d'autres (3 ) sont à soumettre/en préparation. .
Le projet COCERP a pour objectifs la synthèse et l'étude de nouveaux complexes binucléaires de Zn(II)et de Cu(II) capables de reconnaitre préférentiellement la phosphatidylsérine (PS) sur les microvesicules (MVs). Les mécanismes de la reconnaissance/sélectivité seront étudiés pour différents phospholipides anioniques dans des structures de complexité croissante (monomères, vésicules modèles et microvésicules). Ainsi les paramètres (groupes impliqués dans la fixation, mode de fixation, géométrie de la coordination, constantes d’affinité..) qui gouvernent les interactions seront déterminées et à ce stade d’autre types d’assemblages (deuxième génération de senseurs) pourront être conçus afin d’optimiser la reconnaissance de MVs et leur détection. Celles-ci sont issues de cellules (en particulier du système vasculaire, du sang..) qui sous différents stimuli, libèrent des fragments membranaires exposant la PS à l’extérieur des membranes contrairement aux cellules saines. La cytométrie en flux, malgré ses limitations, a montré l'implication de ces microvésicules dans diverses pathologies vasculaires ou dégénératives à forte morbidité. Par conséquent, la quantification et la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des microvésicules sont un défi majeur en matière de santé publique. Pour contourner les défauts et faiblesses des méthodes existantes (cytométrie, dosage prothrombinase après capture sur annexin A5) nous proposons de développer un test, où les MVs seraient captées sur une surface solide grâce à nos complexes de coordination greffés. L’utilisation de ce type de composé supprimera les inconvénients rencontrés avec des tests basés sur des molécules biologiques (interférence d'autres ligands issus des fluides biologiques dont les anticorps, dégradation par protéolyse, sensibilité au calcium) et devrait abaisser les seuils de détection. Pour validation, les essais seront menés sur des MVs issues de cellules isolées puis de plasmas physiologiques et pathologiques et les données comparées aux tests actuels. Ceci est un pré-requis nécessaire au développement du dosage et représente un aspect important de notre projet. COCERP ouvre des perspectives vers le développement d’un test robuste et de faible coût d’identification des MVs, marqueurs du risque cardiovasculaire. Les conséquences socio-économiques des maladies coronariennes ou d’accidents vasculaires cérébraux augurent d’une demande très importante pour une méthodologie simple et rapide, utilisable en routine, pour le dénombrement et la caractérisation complète des microvésicules à des fins de diagnostique précoce pour une prise en charge plus efficace.
Madame Catherine Belle (Département de Chimie Moléculaire)
L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.
LBP - CNRS_UNISTRA Laboratoire de Biophotonique et Pharmacologie_ CNRS_UNISTRA
UPD - UMRS 1140 Université Paris 5 Descartes - Innovations thérapeutiques en hémostase
DCM-CNRS ALPES Département de Chimie Moléculaire
Aide de l'ANR 450 427 euros
Début et durée du projet scientifique :
septembre 2016
- 48 Mois
