DS0402 -

Remodelage de la membrane plasmique par la disponibilité en nutriments – P-Nut

Comprendre comment les carences nutritionnelles contrôlent la capacité d'absorption des nutriments par les cellules.

Les modifications de l'environnement cellulaire peuvent modifier la composition en protéines de la membrane plasmique telles que les transporteurs de nutriments. Cela se produit via leur endocytose, un processus sélectif. Les mécanismes de régulation de l'endocytose des transporteurs par le statut nutrionnel du milieu sont mal décrits, malgré leur rôle essentiel dans l'homéostasie cellulaire. Nous caractériserons les mécanismes contrôlant ces événements dans le cas de carences en nutriments.

Vers de nouveaux mécanismes par lesquels les arrestines remodèlent la présence des transporteurs à la surface des cellules par endocytose.

Tâche 1. Identification et caractérisation des cargos régulés par la carence en glucose. <br />a. Quelle est l'ampleur de l'endocytose induite par la carence ? <br />Utiliser une combinaison de protéomique et de criblage par imagerie pour déterminer l'étendue du réarrangement des protéines membranaires pendant la carence de glucose dans les cellules sauvages. <br />b. Quelles ARTs régulent quels cargos lors d'une endocytose induite par la carence ? <br />Étudier l'implication de la protéine ART Csr2 dans l'endocytose en réponse à la carence en glucose. <br /> <br />Tâche 2. Mécanismes moléculaires de l'endocytose induite par la carence en nutriments. <br />a. Comment les complexes ART-Rsp5 sont-ils activés lors de la carence ? <br />Étudier comment les changements d'expression de l'arrestine, les modifications post-traductionnelles (phosphorylation et ubiquitylation) agissent sur son activité lors de la carence en glucose, en se concentrant sur la protéine ART Csr2. Nous caractériserons également les voies de signalisation impliquées. <br />b. Comment les cargos sont-ils reconnus par les ARTs dans des conditions physiologiques spécifiques ? <br />Obtenir la preuve d'une interaction entre Csr2 et ses cargos, et comprendre comment elle est régulée. <br /> <br />Tâche 3 / Acteurs supplémentaires requis pour l'endocytose lors de la carence en glucose <br />Nous exploiterons les résultats d'un crible d'imagerie à haut débit pour les mutants affectés dans l'endocytose pendant la carence en glucose en utilisant une plateforme automatisée. ????Nous hiérarchiserons les candidats en utilisant les informations disponibles dans les bases de données et sélectionnerons ceux qui ont des liens avec les voies de trafic ou de signalisation des nutriments. Nous vérifierons leur implication dans l'endocytose des transporteurs-GFP induite par la carence (tâche 1) et confirmerons les résultats par divers moyens.

Une combinaison de cribles génétiques, d'imagerie de cellules vivantes, de transcription et d'analyses protéomiques a révélé comment les cellules de levure orchestrent l'endocytose lors d’une carence en nutriments. Un certain nombre de souches de levure exprimant divers transporteurs marqués par la GFP ont été testées pour leur capacité à endocyter les transporteurs marqués pendant la privation de nutriments. Divers mutants ont ensuite été testés pour leur incapacité à effectuer cette endocytose. Une fois identifiées, les protéines en charge de ce processus ont été étudiées pour comprendre leur régulation dans le contexte physiologique de la carence. Des analyses de leurs modifications transcriptionnelles et post-traductionnelles ont révélé les bases moléculaires de cette régulation. En particulier, une approche innovante d'étude de l'ubiquitylation des protéines basée sur la complémentation en luciférase fractionnée a été développée dans le laboratoire partenaire (equipe Rabut IGDR/Rennes) et appliquée à nos protéines d'intérêt. Grâce à des analyses génétiques, cette approche a été reliée aux voies de signalisation des nutriments afin de l'intégrer dans un contexte plus large.

Une combinaison de cribles génétiques, d'imagerie de cellules vivantes, d’études transcriptionnelles et d'analyses protéomiques a révélé comment les levures déclenchent l'endocytose lors d'une carence en nutriments. Nos résultats préliminaires suggèrent que la privation de glucose induit l'endocytose de nombreux transporteurs. Des souches exprimant divers transporteurs marqués à la GFP ont été testées pour leur capacité à endocyter ces transporteurs lors de la carence. Divers mutants ont ensuite été testés. Une fois identifiées, les protéines en charge de ce processus ont été étudiées pour comprendre leur régulation dans le contexte physiologique de la carence. Des analyses de leurs modifications transcriptionnelles et post-traductionnelles ont révélé les bases moléculaires de cette régulation. Cette endocytose diffère de celle observée dans les cellules cultivées en présence glucose, car elle nécessite des complexes ubiquitine ligase distincts régulés par des mécanismes nouveaux. En particulier, une approche innovante pour étudier l'ubiquitylation des protéines basée sur la complémentation de la luciférase fractionnée a été développée dans le laboratoire partenaire (équipe G. Rabut IGDR/Rennes) et appliquée à nos protéines d'intérêt. Grâce à des analyses génétiques, cette régulation a été reliée aux voies de signalisation nutritionnelles afin de l'intégrer dans un contexte plus large. Des mécanismes parallèles ont été identifiés dans le contexte de la privation d'azote. Nous avons également étudié la régulation de l'endocytose lors d'un défi métabolique par l'analogue du glucose, le 2-désoxyglucose.
Nos résultats ont mis en évidence de nouveaux mécanismes par lesquels les cellules régulent leurs protéines de surface en réponse à des défis nutritionnels. Ces mécanismes contribuent à l'adaptation et à la viabilité des cellules pendant la carence et peuvent être liés à des situations patho-physiologiques spécifiques telles que le cancer.

La plupart des objectifs concernant la compréhension mécanistique de la régulation de l'endocytose pendant la carence (glucose ou azote) ont été atteints et publiés. Certaines stratégies techniques n'ont pas abouti (ex. BioID, MS des protéines membranaires) mais ont été substituées par des stratégies alternatives telles que détaillées dans le projet original (ex. BiFC, imagerie des transporteurs-GFP, respectivement). Certains aspects du projet, comme la découverte de nouveaux régulateurs par criblage à haut débit, ont été compliqués par le fait que certains résultats n'ont pas été confirmés, laissant quelques candidats difficiles à relier à l'endocytose et qui, à ce stade du projet, ne pouvaient plus être exploités dans le temps imparti. Cependant, des voies de recherche nouvelles et inattendues ont été développées, comme l'utilisation de l'inhibiteur métabolique 2-désoxyglucose pour imiter la carence et déclencher l'endocytose, un sujet maintenant poursuivi dans le laboratoire grâce à d'autres financements.

- Ivashov V, Zimmer J, Schwabl S, Kahlhofer J, Weys S, Gstir R, Jakschitz, T, Kremser, L, Bonn, G, Lindner, H, Huber, L, Léon, S, Schmidt, O, Teis, D (2020) Complementary a-arrestin-Rsp5 complexes control selective nutrient transporter endocytosis in response to amino acid availability. eLife 9:e58246
- Le Boulch M, Brossard A, Le Dez G, Léon S, Rabut G. (2020) Sensitive detection of protein ubiquitylation using a protein-fragment complementation assay. J Cell Sci 133: jcs243733
- Defenouillere Q#, Verraes A#, Laussel C, Friedrich A, Schacherer J, Léon S (2019) The regulation of HAD-like phosphatases by signaling pathways modulates cellular resistance to the metabolic inhibitor, 2-deoxyglucose. Science Signaling 12:eaaw8000
? Press release: insb.cnrs.fr/fr/cnrsinfo/une-strategie-de-resistance-un-inhibiteur-metabolique-decouverte-grace-la-levure
- Hovsepian J, Albanèse V, Becuwe M, Ivashov V, Teis D, Léon S (2018). The yeast arrestin-related protein Bul1 is a novel actor of glucose-induced endocytosis. Mol Biol Cell. 29:1012-1020.
- Hovsepian J, Defenouillère Q, Albanèse V, Váchová L, Garcia C, Palková Z, Léon S. (2017) Multilevel regulation of an a-arrestin by glucose depletion controls hexose transporter endocytosis. J Cell Biol. 216:1811-31.
? Press release: insb.cnrs.fr/fr/cnrsinfo/comment-les-cellules-sadaptent-elles-une-carence-en-sucre

La capacité des cellules à répondre à des variations quantitatives de facteurs de croissance ou de nutriments dans leur environnement est essentielle pour leur croissance et leur survie. Une réponse centrale à ces changements environnementaux est la reconfiguration de la composition protéique de la membrane plasmique, notamment via leur endocytose. L’endocytose permet de retirer de la membrane plasmique, de façon sélective, ces protéines membranaires. Ceci requiert leur conjugaison préalable à l’ubiquitine, qui agit comme un signal de reconnaissance pour leur endocytose. Une fois ubiquitinées, les protéines membranaires sont internalisées et transportées de façon sélective vers les corps multivésiculaires (MVBs) puis vers les lysosomes pour y être dégradées. Ainsi, l’ubiquitination des protéines de la membrane plasmique et leur dégradation détermine comment les cellules répondent et s’adaptent à des changements du milieu. Les mécanismes moléculaires conduisant à l’ubiquitination de récepteurs tels que l’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) en réponse à sa liaison au ligand sont bien caractérisés, et des défauts dans cette voie contribuent à des pathologies telles que le cancer. En revanche, peu d’informations sont disponibles quant à la régulation de l’ubiquitination et de l’endocytose de transporteurs de nutriments par ces changements nutritionnels du milieu, malgré leur rôle essentiel dans l’homéostasie cellulaire.
Nous avons été parmi les premiers à détailler les mécanismes moléculaires responsables de l’endocytose de transporteurs en réponse à un excès de nutriments dans le milieu (équipe Léon ; Becuwe et al. J Cell Biol 2012 et eLife, 2014). A l’inverse, nous avons récemment démontré qu’une forte carence nutritionnelle induit aussi la dégradation sélective de nombreuses protéines de la membrane plasmique, dont de nombreux transporteurs (équipe Teis ; Mueller et al. eLife, 2015). Ces travaux ont indiqué une fonction essentielle de l’endocytose en réponse à la carence pour la survie cellulaire. Dans ce projet, nous souhaitons obtenir une compréhension globale des mécanismes moléculaires contrôlant l’ubiquitination et l’endocytose de transporteurs lors d’une carence nutritionnelle.
Nos résultats préliminaires indiquent que la carence en glucose déclenche l'endocytose de nombreux transporteurs nutritionnels. Cette endocytose diffère de l’endocytose « classique », décrite en cellules en prolifération, car elle utilise des complexes de type ubiquitine ligase distincts qui sont régulés par des mécanismes nouveaux. Nous souhaitons maintenant caractériser de façon systématique l'amplitude du remodelage du protéome membranaire lors d'une carence en glucose, et comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents. Nous avons d'ores et déjà identifié deux voies distinctes qui régule l'endocytose lors d'une carence en glucose. Nous étudierons l'impact de chacune de ces voies sur le remodelage du protéome membranaire, les bases moléculaires permettent la sélection des cargos membranaires, et leur régulation par des signaux nutritionnels. Ce travail fournira de déterminer l'impact de cette régulation sur la survie de cellules en conditions de carence.
Pour réaliser ces objectifs, nous nous appuierons sur l’expertise complémentaire de nos trois laboratoires et combinerons, chez la levure, des approches de génétique, d’imagerie et de protéomique quantitative. Nos résultats auront une portée large vis à vis de la compréhension des mécanismes permettant à la cellule d’adapter son protéome membranaire aux conditions nutritionnelles du milieu, qui est central dans de nombreuses maladies métaboliques et le cancer.

Coordinateur du projet

Monsieur Sébastien LEON (Institut Jacques Monod (IJM) - UMR7592 CNRS/Univ. Paris-Diderot)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IMU-Biocenter Innsbruck Medical University, Biocenter, Division Cell Biology
IGDR Institut de génétique et développement de Rennes (IGDR) - UMR6290 CNRS/Université Rennes 1
IJM Institut Jacques Monod (IJM) - UMR7592 CNRS/Univ. Paris-Diderot

Aide de l'ANR 268 012 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2016 - 36 Mois

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