Etude par RMN du complexe L,D-transpeptidase/peptidoglycan et de son influence sur la maturation de la paroi des mycobactéries – TransPepNMR

Dans un contexte de résistance croissante aux antibiotiques, ce projet s’inscrit dans une dynamique de recherche fondamentale visant à augmenter les connaissances sur les cibles impliquées dans la biogénèse de la paroi bactérienne. En comblant la brèche entre approches moléculaires et cellulaires, le but du projet est de fournir des informations structurales à l’échelle atomique sur l’interaction entre polymères pariétaux et enzymes de synthèse dans des systèmes de complexité croissante. Pour ce faire, nous développerons de nouvelles approches s’appuyant sur la RMN biomoléculaire à l’état solide et des techniques d’hyperpolarisation nucléaire (DNP). De plus, des techniques de pulse-chase combinées à la spectrométrie de masse seront implémentées pour suivre les modifications de ces polymères au cours du cycle cellulaire. Le consortium multidisciplinaire composé d’experts en RMN et DNP à l’état solide, microbiologie, biochimie, et biologie structurale s’intéressera tout particulièrement à l’interaction entre peptidoglycane (PG) et L,D-transpeptidases (Ldt) chez Mycobacterium tuberculosis. Le choix de cette espèce est motivé par l’émergence de souches extrêmement résistantes aux antibiotiques et par l’importance des Ldt comme cibles thérapeutiques chez ce pathogène.
A ce jour, l’interaction entre transpeptidases (TP) et substrats a principalement été étudiée via de petits analogues de précurseurs du PG sans s’intéresser au PG entier. Nos investigations récentes sur la Ldt de Bacillus subtilis ont montré que la reconnaissance du PG implique des domaines distants du site actif de l’enzyme. Ces domaines restent à identifier et caractériser chez les mycobactéries. Le premier volet du présent projet vise donc à déterminer structure et dynamique de l’interaction entre PG intact et LdtMt par RMN du solide. De premières informations structurales seront obtenues à partir de mesures de perturbation du déplacement chimique. Une détermination plus fine impliquera des mesures de distances nécessitant la combinaison de techniques de pointe en RMN et marquage isotopique. Le mode de fonctionnement des Ldt gagnera ainsi en compréhension.
Le second volet déterminera les rôles respectifs des L,D- et D,D-TP dans la réticulation du PG au cours de sa croissance et de sa maturation chez les mycobactéries. Des techniques de pulse-chase et de spectrométrie de masse seront développées pour différentier les unités de PG néo-synthétisées et préexistantes et pour quantifier les contributions respectives des deux TP au cours de la croissance. Type et nature des modifications chimiques impliquées dans la maturation du PG seront ensuite déduits. Ces analyses seront réalisées sur des bacilles isolés dans différentes phases de croissance (exponentielle, stationnaire, dormante), ainsi que sous stress antibiotique. Ce volet mettra en lumière le rôle de la maturation et du renouvellement du PG dans la transition des cellules entre diverses phases.
Le troisième volet consiste à développer de nouveaux outils pour la biologie structurale intégrative, basés sur la DNP. Le potentiel de cette technique pour améliorer la sensibilité et la sélectivité envers des composants spécifiques de la paroi des mycobactéries sera exploré. En parallèle, les limites actuelles de résolution spectrale seront levées en combinant marquage isotopique sélectif et techniques spectrales spécifiques. Des méthodes synergiques de marquage de spins et d’isotopes seront conçues sur Ldt et PG pour obtenir des informations structurales spécifiques de l’interaction, première étape vers l’investigation plus générale d’interfaces par DNP. La réalisation de ce volet conduira à une percée majeure pour l’application de la DNP dans l’étude structurale d’assemblages biomoléculaires.
Les avancées faites grâce à ce projet dans la compréhension de la biosynthèse et maturation du PG pourront déboucher sur l’identification de nouvelles stratégies pour l’éradication de souches multirésistantes de M. tuberculosis.