Étude structurale et fonctionnelle de la protéine RbpA de Mycobacterium: un régulateur principal de l'expression des gènes impliqués dans la pharmacorésistance – MycoMaster

La cartographie des gènes dépendants de RbpA est réalisée en utilisant un Run-Off assay in vitro sur l'ADN génomique total de M. tuberculosis suivi d'une analyse par microarray et ARN-seq des transcrits d'ARN (ROR-seq). Les cibles de RbpA définies par l'approche in vitro seront validées par l'analyse ChIP-seq en utilisant des souches de Mycobacterium non-pathogènes. Ainsi, la majorité des promoteurs liés par l'activateur dans une cellule vivante pourraient être identifiée. En parallèle, les fragments d'ADN de promoteur synthétique contenant différentes combinaisons des motifs d'ADN de promoteur et leurs dérivés mutants sont utilisés dans des dosages biochimiques pour évaluer l'effet de RbpA sur l'activité de l'ARNP. Les structures de RNAP contenant sigma-B, son complexe avec RbpA et l'ADN sont explorés en utilisant l'analyse Cryo-EM à haute résolution. Comme approche complémentaire, nous utilisons la diffraction des micro-électrons (micro-ED) qui est une bonne alternative à la diffraction des rayons X. Pour déterminer les résidus spécifiques des sous-unités RNAP essentielles pour la fonction de RbpA, les sites de liaison RbpA sont explorés par la mutagenèse suivie par l'analyse des mutants dans les dosages biochimiques.

Nous avons trouvé que RNAP, contenant la sous-unité sigma-B, adopte une conformation inactive inhabituelle qui est convertie en la conformation active après la liaison avec RbpA. Nos données fournissent une base structurelle pour la régulation du gène de réponse au stress chez M. tuberculosis.

Le contrôle et la prévention de la tuberculose ont été définis par le Centre européen de prévention et de contrôle des maladies (ECDC) comme l'un des domaines de travail prioritaires. Notre étude va construire un modèle structurel de la RNAP de M. tuberculosis en complexe avec un activateur transcriptionnelle inhabituel et aidera à caractériser les caractéristiques spécifiques de la machinerie de transcription mycobactérienne qui déterminent sa haute tolérance aux médicaments. Les résultats de notre projet contribueront à la compréhension des mécanismes de la pathogenèse et de la persistance chez M. tuberculosis. Nous nous attendons à avoir un aperçu du rôle de RbpA dans la régulation des gènes impliqués dans la résistance aux médicaments cliniques comme la rifampicine, l'isoniazide et les aminoglycosides.

1. Vishwakarma,R.K., Cao,A.M., Morichaud,Z., Perumal,A.S., Margeat,E. and Brodolin,K. (2018) Single-molecule analysis reveals the mechanism of transcription activation in M. tuberculosis. Sci Adv. 4(5):eaao5498. doi: 10.1126/sciadv.aao5498.

2. Perumal, A.S., Vishwakarma, R.K., Hu, Y., Morichaud Z. Brodolin, K. (2018) RbpA relaxes promoter selectivity of M. tuberculosis RNA polymerase. Nucl Acids Res. doi: 10.1093/nar/gky714

Mycobacterium tuberculosis, l'agent pathogène humain causant la tuberculose, est responsable de ~1,5 million de décès chaque année dans le Monde et ~5000 cas sont diagnostiqués chaque année en France. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques requiert une connaissance approfondie des mécanismes moléculaires conférant la résistance aux antibiotiques. Notre projet vise à comprendre les mécanismes spécifiques de la régulation des gènes qui permettent à M.tuberculosis de survivre aux traitements antibiotiques et de provoquer une infection récurrente. Dans ce but, nous employons une approche multidisciplinaire combinant des méthodes génomiques, biochimiques et biophysiques. Les résultats de notre projet aideront à comprendre les mécanismes de la pathogenèse et fourniront de nouveaux concepts et cibles pour le design de médicament