Nouvelle génération de sondes ARN fluorogènes brillantes pour le suivi de l’expression des gènes à haute sensibilité par imagerie sur cellules vivantes – BrightRiboProbes

L’homéostasie de la cellule et son adaptation aux changements environnementaux repose sur une régulation fine et coordonnée de l’expression des gènes. Celle-ci se fait notamment par des réseaux de régulation complexes impliquant des protéines et des ARN souvent non-codants. Connaître les différents acteurs d’une voie de régulation mais aussi sa dynamique sont des éléments clés pour la compréhension de ces mécanismes, de leur intégration et des conséquences de leur dysfonctionnement. Par ailleurs, chaque cellule d’une population adaptant différemment son profil d’expression génique, ces études doivent atteindre une résolution à la cellule unique. Ainsi, caractériser la dynamique des voies de régulation de l’expression des gènes nécessite l’utilisation de technologies non disruptives, peu invasives et permettant le suivi prolongé d’une même population de cellules vivantes. Les approches d’imagerie permettent d’accéder à ces objectifs pourvu que des sondes fluorescentes suffisamment brillantes soient disponibles. Alors que l’essor des protéines fluorescentes a grandement facilité l’imagerie de l’expression de gènes codant pour des protéines, celle de gènes d’ARN non codant est techniquement plus complexe.
Le projet BightRiboProbes trouve sa motivation dans le constat qu’un sérieux déficit existe actuellement dans les technologies d’imagerie de l’ARN in cellulo. En effet, à l’heure actuelle l’imagerie d’ARN peu abondants se fait par des approches d’hybridation in situ dont la première étape consiste à fixer et perméabiliser les cellules. Même si cette approche s’avère très sensible, elle ne permet pas d’apprécier la dynamique d’expression des gènes cibles. Cette information pourrait être obtenue au moyen de constructions chimères où l’ARN d’intérêt serait couplé à un ARN aptamère fluorogène capable de lier et d’activer la fluorescence de fluorophores organiques. Cependant, les systèmes actuels présentent soit une bonne affinité entre l’ARN et le co-facteur mais une faible brillance, soit une forte brillance mais une faible affinité ce qui, dans les deux cas, limite l’utilisation aux ARN fortement exprimés et ne permet pas le suivi d’ARN présents en faible quantité tels que les ARN messagers et de nombreux ARN régulateurs.
Ce projet a pour objectif de créer une technologie de rupture qui permettra de réaliser le suivi de la synthèse d’ARN peu abondants par des expériences d’imagerie sur cellules vivantes dans un système modèle bactérien. Nous synthétiserons de nouvelles générations de molécules fluorogènes très brillantes mais éteintes à l’état libre et capables d’entrer dans des cellules en culture. En parallèle, nous développerons des aptamères ARN capables de reconnaître spécifiquement et avec haute affinité ces composés fluorogènes pour activer leur fluorescence de façon optimale. Nous génèrerons ainsi des couples fluorophores/ARN émettant une fluorescence verte, rouge et rouge lointain et les validerons (expression stable des ARN et entrée efficace des fluorophores) in vivo au sein des bactéries et dans des cellules eucaryotes. Enfin, nous appliquerons cette nouvelle génération de sondes fluorescentes en combinaison avec la microscopie à fluorescence conventionnelle et la microscopie à super résolution pour caractériser la dynamique d’un réseau contrôlant la synthèse temporelle des facteurs de virulence de Staphylococcus aureus. Ces données permettront non seulement l’établissement de cinétiques précises de l’expression des gènes de virulence, mais aussi de distinguer les cellules où cette activation a lieu et d’analyser l’influence de divers stresses sur la dynamique du réseau pour visualiser le comportement individuel et collectif des bactéries au sein de la population.
Ces objectifs ambitieux seront atteints en associant trois équipes avec les compétences complémentaires et nécessaires en chimie, évolution d’ARN, génétique, microbiologie, microfluidique et microscopie à super résolution.