CE05 - Production et gestion des énergies renouvelables

Développement des bactéries cellulolytiques Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum comme biocatalyseurs pour la conversion de la biomasse végétale en alcools supérieurs – Phytocell

Construction des bactéries qui transforment la biomasse en butanol

Les bioraffineries pour la transformation de la biomasse en carburants et en produits de commodité constituent une alternative potentielle aux raffineries de pétrole. La biomasse lignocellulosique pourrait contribuer à l'approvisionnement énergétique mondial sans diminuer la production alimentaire et réduire les émissions de gaz à effet de serre. Ce projet vise à développer des microorganismes qui transforment directement la biomasse lignocellulosique en butanol, solvant et carburant attractif.

L'objectif du projet Phytocell est de développer Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum en tant que plates-formes microbiennes pour la conversion de la biomasse en butanol.

Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum pourraient être développés en tant que bio-catalyseurs efficaces pour la transformation directe de la biomasse en butanol par le CBP (Consolidated BioProcessing). Actuellement, la recherche s’est relativement peu concentrée sur les bactéries cellulolytiques et anaérobies en tant qu'organismes «  CBP », principalement parce que les outils génétiques ne sont disponibles que récemment. C. phytofermentans et C. cellulolyticum sont des anaérobies mésophiles, non pathogènes, isolées du sol. Ces bactéries poussent sur les composants solubles et insolubles de la biomasse végétale (cellulose, hémicellulose, amidon et pectine) en clivant d'abord les polysaccharides végétaux, puis en fermentant les sucres pentose et hexose. Alors que C. phytofermentans et C. cellulolyticum fermentent la biomasse lignocellulosique, il existe des différences physiologiques entre les souches. C. phytofermentans possède une gamme d’enzymes pour la dégradation de la biomasse (CAZymes) plus large et plus diversifiée, ce qui lui permet de métaboliser de nombreux polysaccharides. Elle se développe également plus rapidement et fermente spécifiquement en éthanol, produisant des titres plus élevés que C. cellulolyticum. Cependant, C. cellulolyticum dégrade plus efficacement la cellulose. De plus, C. cellulolyticum rassemble la plupart de ses cellulases et hémicellulases dans de grands complexes multi-enzymatiques appelés cellulosomes. L'objectif du projet Phytocell est de rassembler deux centres de recherche français, l'un à Évry focalisé sur C. phytofermentans et l'autre à Marseille, focalisé sur le C. cellulolyticum, pour développer ces bactéries comme plates-formes pour la transformation de la biomasse en butanol.

Phytocell est organisé en 4 projets de recherche:

*Projet 1 L'expression de mini-cellulosomes synthétiques composés de cellulases sélectionnées dérivées de C. cellulolyticum chez C. phytofermentans pour améliorer sa capacité à se dégrader et à se développer sur de la cellulose récalcitrante. Les phases du projet 1 comprennent l'assemblage de constructions d'ADN de mini-cellulosomes, le transfert de plasmides et l'étude de mini-cellulosomes chez C. phytofermentans.

*Projet 2 met en œuvre une voie synthétique de synthèse du butanol chez C. phytofermentans et C. cellulolyticum. Les phases du projet 2 comprennent la construction des voies, la mise en œuvre dans les souches WT, la mise en œuvre de souches optimisées et l'optimisation du CBP par élimination des produits de fermentation alternatifs.

*Projet 3 est l'amélioration de la résistance au butanol. Il comprend la sélection des souches de C. phytofermentans et de C. cellulolyticum par evolution dirigee et le séquençage / phénotypage des souches évoluées.

*Projet 4 est constitué d'outils génétiques fondamentaux pour améliorer ces clostridies en tant qu'organismes CBP. Il comprend la construction de plasmides, les méthodes d'insertion et de délétion génomiques dans les deux souches, l'insertion génomique de mini-cellulosomes chez C. phytofermentans et la suppression de voies de fermentation alternatives du candidat final au CBP.

*Projet 1 Le CNRS-LCB avait anticipé que la construction d’un vecteur contenant une mini-cellulosome s’avèrerait très toxique pour E. coli, bactérie que nous devons utiliser pour propager le vecteur. Diverses stratégies ont été employées pour bloquer l’expression des gènes chez E. coli, tout en maintenant leur expression chez les Clostridies.

*Projet 2 Le CNRS-LCB a construit et transformé les vecteurs « métaboliques » pour C. cellulolyticum. Des croissances de la souche transformée ont démontré un profil de fermentation different, mais peu de butanol. Nous sommes en train d’optimiser l’expression de la voie chez C. cellulolyticum, et de tester les vecteurs dans les souches disponibles de C. phytofermentans.

*Projet 3 Une souche de C. phytofermentans a été évoluée dans l’automate GM3. Le séquençage de la souche résistante est en cours, pour identifier les mutations impliquées dans la tolérance au butanol chez C. phytofermentans

*Projet 4 Pour éliminer les autres produits de fermentation chez C. phytofermentans, nous avons développé une méthode de délétion à grande échelle. Nous avons également testé des origines de réplication de bactéries Gram+ et un rapporteur génétique. En ce qui concerne C. cellulolyticum, l’outil CRISPR-Cas9n s’est avéré non-fonctionnel chez C. cellulolyticum.

Jusqu'à présent, nous avons réalisé plusieurs avancées essentielles à la réalisation des objectifs de Phytocell et au développement de bio-catalyseurs microbiens pour la transformation de la biomasse en butanol.

La résistance au butanol de la souche de C. phytofermentans évoluée est fortement augmentée. La séquence génomique de cette souche permettra l’identification des gènes impliqués dans la résistance microbienne au butanol.

La méthode de délétion à grande échelle a été validée chez C. phytofermentans. Cette approche pourra effectuer les grandes délétions chez tous les Clostridia.

La souche de C. cellulolyticum contenant le vecteur métabolique de la voie de synthèse de butanol produit peu de butanol, mais fait tout de même deux fois plus d’éthanol que la souche contrôle sur cellobiose et cellulose cristalline.

Cerisy T, Souterre T, Torres-Romero I, Boutard M, Dubois I, Patrouix J, Labadie K, Berrabah W, Salanoubat M, Doring V, Tolonen AC (2017). Evolution of a biomass-fermenting bacterium to resist lignin phenolics. Appl Environ Microbiol. 17;83(11).

Nous proposons un projet de 4 ans pour développer Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum comme plates-formes pour la conversion de biomasse végétale en alcool. Ces deux espèces bactériennes dégradent et fermentent naturellement la cellulose et les autres polysaccharides associés dans les végétaux, ce qui en fait des candidats idéaux pour la biotransformation directe de la biomasse végétale en biocarburants et produits de commodité par « Consolidated BioProcessing » (CBP). Dans le contexte d’un CBP, la production d’enzyme, l’hydrolyse, et la fermentation s’effectuent dans un réacteur unique, diminuant ainsi le capital et les coûts opérationnels. Dans ce projet, nous nous concentrons sur la transformation de la biomasse en n-butanol (désigné ci-après butanol), qui constitue un carburant et un solvant attractif, tandis qu’un nouveau procédé permet de le convertir en carburant avion et biodiesel à des rendements élevés. Nous planifions de modifier chaque organisme pour augmenter sa tolérance au butanol, et introduire une voie de synthèse du butanol. Nous évaluerons le potentiel de chaque organisme pour la production de butanol à partir de biomasse végétale, et la souche la plus performante sera à nouveau modifiée pour répondre aux critères d’une production à faible coût de butanol à partir de biomasse en CBP.

Ce projet repose sur les expertises complémentaires de groupes académiques du Génoscope-CEA à Evry et du Laboratoire de Chimie Bactérienne à Marseille pour étudier et améliorer les clostridies cellulolytiques. Ainsi, ce projet diverge considérablement des autres projets de biocarburants cellulosiques menés aux USA, en Europe et en Asie, visant à rendre cellulolytiques des organismes modèles qui fermentent les sucres simples en éthanol (Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli) ou butanol (Clostridium acetobutylicum). Aucun de ces projets n’a jusqu’ici abouti à un organisme réellement cellulolytique, probablement parce qu’une dégradation efficace de la biomasse lignocellulosique requiert des adaptations comme l’adhérence aux substrats végétaux insolubles, la synthèse coordonnée de nombreuses enzymes dégradatives des polysaccharides végétaux et une tolérance aux inhibiteurs libérés pendant la dégradation. Nous avons donc une autre approche de cette problématique basée sur la modification de bactéries dégradant naturellement la biomasse lignocellulosique, pour la production de butanol.

Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum sont deux bactéries mésophiles anaérobies fermentant la cellulose et les autres polysaccharides des parois végétales comme l’hémicellulose et la pectine. Les génomes de ces deux bactéries, qui ont été intégralement séquencés, présentent des pourcentages en GC et des utilisations des codons très similaires. Malgré tout, elles présentent aussi des différences marquées. C. phytofermentans fermente la cellulose essentiellement en éthanol, avec un rendement de 70 % du rendement théorique maximal, et des titres pouvant atteindre 7 g L-1 en éthanol. A l’inverse, C. cellulolyticum fermente la cellulose en premier lieu en acétate et lactate, et des titres en éthanol atteignant à peine 0.7 g L-1. Cependant, C. cellulolyticum dégrade la cellulose cristalline plus efficacement que C. phytofermentans, probablement car C. phytofermentans secrète ses cellulases à l’état libre tandis que C. cellulolyticum regroupe ses cellulases dans un complexe extracellulaire, le cellulosome. Il a été montré que la formation du cellulosome augmente considérablement l’activité des cellulases et améliore la dégradation de la cellulose et des biomasses végétales brutes. En combinant les recherches sur ces deux bactéries cellulolytiques, l’une spécialisée dans la dégradation rapide de la cellulose, et l’autre dans la production d’alcool, ce projet intégrera les avantages des deux organismes pour développer une nouvelle souche capable de convertir efficacement la biomasse cellulosique en butanol.

Coordinateur du projet

UMR8030/GENOSCOPE/CEA (Divers public)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Centre National de la Recherche Scientifique délégation Provence et Corse, laboratoire de Chimie Bactérienne
UMR8030/GENOSCOPE/CEA

Aide de l'ANR 501 183 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2016 - 48 Mois

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