DS0204 -

Développement des bactéries cellulolytiques Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum comme biocatalyseurs pour la conversion de la biomasse végétale en alcools supérieurs – Phytocell

Construction des bactéries qui transforment la biomasse en butanol

Les bioraffineries pour la transformation de la biomasse en carburants et en produits de commodité constituent une alternative potentielle aux raffineries de pétrole. Ce projet vise à développer des microorganismes qui transforment directement la biomasse lignocellulosique en butanol.

L'objectif du projet Phytocell est de développer des clostridies cellulolytiques en tant que plates-formes microbiennes pour la conversion de la biomasse en butanol.

Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum pourraient être développées en tant que bio-catalyseurs efficaces pour la transformation directe de la biomasse en butanol par CBP (Consolidated BioProcessing). Actuellement, la recherche s’est relativement peu concentrée sur les bactéries cellulolytiques et anaérobies en tant qu'organismes « CBP », principalement parce que les outils génétiques n’ont été disponibles que récemment. C. phytofermentans et C. cellulolyticum sont des anaérobies mésophiles, non pathogènes, isolées du sol. Ces bactéries poussent sur les composants solubles et insolubles de la biomasse végétale en clivant d'abord les polysaccharides végétaux, puis en fermentant les sucres pentose et hexose. Alors que ces deux bactéries fermentent la biomasse lignocellulosique, il existe des différences physiologiques entre ces souches. L'objectif du projet Phytocell est de rassembler deux centres de recherche français, l'un à Évry focalisé sur C. phytofermentans et l'autre à Marseille, focalisé sur le C. cellulolyticum, pour développer ces bactéries comme plateformes pour la transformation de la biomasse en butanol.

*Projet 1 L'expression de mini-cellulosomes synthétiques composés de cellulases sélectionnées dérivées de C. cellulolyticum chez C. phytofermentans pour améliorer sa capacité à se dégrader et à se développer sur la cellulose récalcitrante.

*Projet 2 met en œuvre une voie synthétique de synthèse du butanol chez C. phytofermentans et C. cellulolyticum. Les phases du projet 2 comprennent la construction des voies, la mise en œuvre dans les souches WT, la mise en œuvre de souches optimisées et l'optimisation du CBP par l’élimination des produits de fermentation alternatifs.

*Projet 3 consiste en l'amélioration de la résistance au butanol. Il comprend la sélection des souches de C. phytofermentans et de C. cellulolyticum par évolution dirigée et le séquençage / phénotypage des souches évoluées.

*Projet 4 consiste au développement d'outils génétiques fondamentaux pour améliorer ces clostridies en tant qu'organismes CBP. Il comprend la construction de plasmides, les méthodes d'insertion et de délétion génomiques dans les deux souches, l'insertion génomique de mini-cellulosomes chez C. phytofermentans et la suppression de voies de fermentation alternatives du candidat final au CBP.

*Nous avons implémenté une voie de synthèse complète du butanol chez C. cellulolyticum et C. phytofermentans. Cette voie est fonctionnelle chez C. cellulolytcium, mais a produit de faibles niveaux de butanol, et nécessite des améliorations pour augmenter ce taux, y compris chez les souches rendues tolérantes au butanol.

*Les deux clostridies ont été évoluées pour croître dans 2,5% (v/v) de butanol dans le milieu de croissance, ce qui dépasse le potentiel de production de tout micro-organisme connu.
*
Nous avons développé une série d’outils génétiques pour modifier plus facilement les génomes de ces deux clostridies

Nous avons réalisé des percées pour le développement de biocatalyseurs microbiens pour la conversion de la biomasse en butanol.

Nous avons réussi l’introduction d’une voie complète du butanol chez des clostridies cellulolytiques. L’amélioration du rendement en butanol est désormais possible grâce aux outils génétiques mis au point lors du projet, outils également utilisables pour la production d’autres composés d’intérêt par ces clostridies.

Le protocole d’évolution dirigée que nous avons mis au point peut être utilisé pour adapter les deux bactéries à d’autres composés toxiques.

Cerisy T., Iglesias A., Rostain W., Boutard M., Pelle C., Perret A., Salanoubat M., Fierobe H.-P., Tolonen A. C. (2019) ABC Transporters Required for Hexose Uptake by Clostridium phytofermentans. J. Bacteriol. 201:e00241-19


Kampik C., Liu N., Mroueh M., Franche N., Borne R., Denis Y., Gagnot S., Tardif C., Pagès S., Perret S., Vita N., de Philip P., Fierobe H.-P. (2021) Handling several sugars at a time: the case study of xyloglucan utilization by Ruminiclostridium cellulolyticum. in revision at mBio. (in revision)

Rostain W, Boutard M, Tabuteau S, Sanitha M,Tolonen AC. Tuning of gene expression in Clostridium phytofermentans using synthetic promoters and CRISPRi. 2021. (Submitted).

Cerisy T, Rostain W, Chhun A, Boutard M, Salanoubat M, Tolonen AC. A Targetron-Recombinase System for Large-Scale Genome Engineering of Clostridia. mSphere. 2019 Dec 11;4(6):e00710-19. doi: 10.1128/mSphere.00710-19.

Cerisy T, Souterre T, Torres-Romero I, Boutard M, Dubois I, Patrouix J, Labadie K, Berrabah W, Salanoubat M, Doring V, Tolonen AC. Evolution of a Biomass-Fermenting Bacterium To Resist Lignin Phenolics. Appl Environ Microbiol . 2017 May 17;83(11):e00289-17. doi: 10.1128/AEM.00289-17.

Nous proposons un projet de 4 ans pour développer Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum comme plates-formes pour la conversion de biomasse végétale en alcool. Ces deux espèces bactériennes dégradent et fermentent naturellement la cellulose et les autres polysaccharides associés dans les végétaux, ce qui en fait des candidats idéaux pour la biotransformation directe de la biomasse végétale en biocarburants et produits de commodité par « Consolidated BioProcessing » (CBP). Dans le contexte d’un CBP, la production d’enzyme, l’hydrolyse, et la fermentation s’effectuent dans un réacteur unique, diminuant ainsi le capital et les coûts opérationnels. Dans ce projet, nous nous concentrons sur la transformation de la biomasse en n-butanol (désigné ci-après butanol), qui constitue un carburant et un solvant attractif, tandis qu’un nouveau procédé permet de le convertir en carburant avion et biodiesel à des rendements élevés. Nous planifions de modifier chaque organisme pour augmenter sa tolérance au butanol, et introduire une voie de synthèse du butanol. Nous évaluerons le potentiel de chaque organisme pour la production de butanol à partir de biomasse végétale, et la souche la plus performante sera à nouveau modifiée pour répondre aux critères d’une production à faible coût de butanol à partir de biomasse en CBP.

Ce projet repose sur les expertises complémentaires de groupes académiques du Génoscope-CEA à Evry et du Laboratoire de Chimie Bactérienne à Marseille pour étudier et améliorer les clostridies cellulolytiques. Ainsi, ce projet diverge considérablement des autres projets de biocarburants cellulosiques menés aux USA, en Europe et en Asie, visant à rendre cellulolytiques des organismes modèles qui fermentent les sucres simples en éthanol (Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli) ou butanol (Clostridium acetobutylicum). Aucun de ces projets n’a jusqu’ici abouti à un organisme réellement cellulolytique, probablement parce qu’une dégradation efficace de la biomasse lignocellulosique requiert des adaptations comme l’adhérence aux substrats végétaux insolubles, la synthèse coordonnée de nombreuses enzymes dégradatives des polysaccharides végétaux et une tolérance aux inhibiteurs libérés pendant la dégradation. Nous avons donc une autre approche de cette problématique basée sur la modification de bactéries dégradant naturellement la biomasse lignocellulosique, pour la production de butanol.

Clostridium phytofermentans et Clostridium cellulolyticum sont deux bactéries mésophiles anaérobies fermentant la cellulose et les autres polysaccharides des parois végétales comme l’hémicellulose et la pectine. Les génomes de ces deux bactéries, qui ont été intégralement séquencés, présentent des pourcentages en GC et des utilisations des codons très similaires. Malgré tout, elles présentent aussi des différences marquées. C. phytofermentans fermente la cellulose essentiellement en éthanol, avec un rendement de 70 % du rendement théorique maximal, et des titres pouvant atteindre 7 g L-1 en éthanol. A l’inverse, C. cellulolyticum fermente la cellulose en premier lieu en acétate et lactate, et des titres en éthanol atteignant à peine 0.7 g L-1. Cependant, C. cellulolyticum dégrade la cellulose cristalline plus efficacement que C. phytofermentans, probablement car C. phytofermentans secrète ses cellulases à l’état libre tandis que C. cellulolyticum regroupe ses cellulases dans un complexe extracellulaire, le cellulosome. Il a été montré que la formation du cellulosome augmente considérablement l’activité des cellulases et améliore la dégradation de la cellulose et des biomasses végétales brutes. En combinant les recherches sur ces deux bactéries cellulolytiques, l’une spécialisée dans la dégradation rapide de la cellulose, et l’autre dans la production d’alcool, ce projet intégrera les avantages des deux organismes pour développer une nouvelle souche capable de convertir efficacement la biomasse cellulosique en butanol.

Coordination du projet

Tolonen ANDREW (UMR8030/GENOSCOPE/CEA)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS DR12 Centre National de la Recherche Scientifique délégation Provence et Corse, laboratoire de Chimie Bactérienne
UMR8030 UMR8030/GENOSCOPE/CEA

Aide de l'ANR 501 183 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2016 - 48 Mois

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