Ecologie Chimique chez le Dinoflagellé Ostreopsis et son Réseau Allélopathique – OCEAN-15

Tâche 1 : La méthode d’extraction et les conditions d’analyse chimique en LC/MS ont été optimisées pour la détermination des profils toxiniques des échantillons. Le test de cytotoxicité utilisant la culture des cellules Neuro-2A (neuroblastome de souris) a été adapté et optimisé pour l’analyse des extraits de culture d'O. ovata, contenant, en plus des ovatoxines, d’autres métabolites d’intérêts. Cet outil est utilisé dans l’approche de fractionnement bio-guidé sur colonne LH20 dont les fractions obtenues ont fait l’objet de test N-2A et les criblages ciblé (en CL-SM/SM pour le suivi de purification des ovatoxines) et non ciblé (en CL/SM Haute Résolution).
L’étude des voies biosynthétique a été réalisée entre janvier et juin 2017 à l’IAEA (Monaco) par 1-GEOAZUR par experiences de feeding in vivo en utilisant des precurseurs radiomarques.
Tâche 2 : Les données obtenues lors de la 1ère étude de terrain (été 2016) ont permis de fixer les conditions de l’étude du changement global sur l’éco-physiologie et le métabolisme d’Ostreopsis (T°C : 20, 25 et 30°C ; irradiance : 100, 250 et 400 µmol.m-2.s-1 ). Des prélèvements de grandes quantités d’Ostreopsis ont été réalisés in situ afin de fournir du matériel biologique.
Tâche 3 : Une étude du potentiel effet allélopathique par coculture d’Ostreopsis sur des microalgues benthiques concurrentes a été effectuée par 1-GEOAZUR et 2-LOV. Une étude du potentiel effet d’Ostreopsis sur la faune associée (copépodes harpactocoides) a été effectuée.
Tâche 4 : Sur le volet toxicologie santé humaine, les effets de la palytoxine ont été étudiés in vitro sur des modèles cellulaires des épithéliums intestinal et nasal. En l’absence d’autres toxines purifiées, nous avons débuté nos travaux sur la palytoxine sachant que les ovatoxines produites par Ostreopsis ovata en Méditerranée ne sont pas disponibles mais que les premiers résultats montrent que l’ovatoxine-a serait moins toxique que la palytoxine.

Tache 1: Suite à l’étude du profil toxinique de plusieurs souches d’Ostreopsis, le projet a demarré par la sélection de deux souches d’O. ovata isolées. La souche ayant le profil toxinique le plus complexe (MCCV54) a été sélectionné pour les études des tâches 2 et 3 relatives aux études du métabolome et la seconde souche (MCCV55) pour le volet purification des métabolites de la tâche 1. La methode d'analyse par LC-MS ont ete definies pour les toxines.
En ce qui concerne l'etude biosynthetique deux des 4 précurseurs testés ont montré une incorporation non négligeable dans les ovatoxines (la Beta-alanine, et la SAM).
Tache 2 : Le suivi de terrain effectué par 2-LOV durant 2016 a permis de mettre en relation le développement d’Ostreopsis avec des paramètres environnementaux et, contrairement à plusieurs publications , les températures elevees sont néfastes au développement de la microalgue .
Tache 3 : L'etude allelopathique a mis en évidence un effet d’Ostreopsis, mais uniquement par contact. Une action inhibitrice d’O. ovata sur différents producteurs primaires (7 espèces de diatomées et dinoflagellés) a été mise en évidence. Cette interaction impliquerait des métabolites secondaires encore non identifiés. La consommation de la microalgue toxique par les copépodes semble associee a un effet important sur la reproduction de ces crustacés.
Tache 4 : Les résultats de toxicologie ont montré que, après 24 h d’exposition, la palytoxine induit des effets apoptotiques sur les cellules intestinales humaines de type entérocyte Caco2 et une co-culture de cellules entérocytes et à mucus (75% Caco2/25% HT29-MTX). De même, une réponse inflammatoire est observée. Les effets de la palytoxine ont également été recherchés sur un système de culture 3D d’épithélium nasal humain. Après 24 h d’exposition, les résultats ne montrent pas d’effets de la palytoxine entre 0,5 et 10 nM.

Tache 1 : La culture de la souche MCCV55 en grand volume (20 L) est toujours en cours d’amélioration afin de disposer d’une biomasse conséquente pour les travaux de purification et d’isolement des métabolites. L'etude de l'exometabolome est egalement en cours.
En ce qui concerne l'experience de biosynthese, l’evaluation de l’activité spécifique des ovatoxines produites par les cultures d’O. ovata va être déterminée précisément par purification par HPLC et beta-imager pour proposer quelques étapes de la biosynthèse de cette toxine extrêmement complexe.
Tache 2 : Des prélèvements de grandes quantités d’Ostreopsis vont etre realises cet ete 2017 in situ et les premieres etudes sur les changements de parametres environnementaux sur les profils chimiques vont etre realises.
Tache 3: une identification des metabolites secondaires responsables du comportement observe dans l'experience d'allelopathie sera menee. L’étude des relations entre Ostreopsis et différentes espèces de macroalgues se poursuit.
Tache 4: Des extraits bruts cellulaires obtenus dans la tache 1 font également l’objet d’une évaluation toxicologique depuis Mai 2017 et l'etude des effets de la palytoxine sont toujours en cours.

1. Jauzein, C., Couet, D., Blasco, T. & R. Lemée (2017). Uptake of dissolved inorganic and organic nitrogen by the benthic toxic dinoflagellate Ostreopsis cf. ovata. Harmflul Algae, 65: 9-18.
2. Berdalet, E., Tester, P.A., Chinain, M., Fraga, S., Lemée, R., Litaker, W., Penna, A., Usup, G., Vila, M. & A. Zingone (2017). Harmful Algal Blooms in Benthic Systems: Recent progress and future research. Oceanography 30(1): 36-45.

Certaines espèces de microalgues ont développé un métabolisme spécialisé complexe qui conduit à la production de toxines. Ces micro-algues toxiques peuvent proliférer et se concentrer rapidement, créant des blooms toxiques appelés Harmful Algal Blooms (HABs) qui ont des effets néfastes sur l’environnement et la santé humaine. Au cours de la dernière décennie, la prolifération répétée d’un dinoflagellé benthique toxique appartenant au genre Ostreopsis a été observée le long des côtes Méditerranéennes. Les causes responsables de cette prolifération n'ont pas encore été déterminées même si le changement global est certainement impliqué. En effet, du fait de ses caractéristiques géographiques, la Méditerranée est particulièrement sensible aux variations de température et d’intensité de la lumière qui ont pour effet de faire varier la stratification thermique des eaux et par conséquent d’altérer le fonctionnement des écosystèmes.
Les efflorescences d’Ostreopsis ont généré des problèmes de santé publique en Italie et France avec des symptômes variés : fièvre, rhinites, douleurs pharyngées, toux sèche ou moyennement productive, maux de tête … Dans certains cas, ces blooms ont aussi causé des effets délétères sur les communautés benthiques de gastropodes ou d'échinodermes. Ces effets sur la santé et les écosystèmes résulteraient de l’action d’analogues de la puissante palytoxine produits par Ostreopsis cf. ovata : les ovatoxines (a à h). Cependant, le métabolisme spécialisé d’O. cf. ovata n'est à ce jour que partiellement caractérisé, et d'autres métabolites qui doivent être identifiés pourraient être impliqués dans les effets toxiques observés. Les métabolites spécialisés sont également impliqués dans la médiation chimique existant entre les organismes d’un écosystème, et l'influence de ces signaux chimiques d’O. cf. ovata sur le développement des organismes benthiques n’a été que trop rarement étudiée. Ainsi, toute réponse apportée dans ce domaine appelé écologie chimique sera une valeur ajoutée significative.
Dans ce contexte, l’objectif principal d’OCEAN15 est d’étudier les effets du changement climatique sur le métabolisme spécialisé de cette micro-algue afin d’anticiper les modifications potentielles de sa toxicité mais aussi des interactions écologiques qui altèreront les écosystèmes. Cet objectif correspond au défi sociétal 1 listé dans l'ANR générique 2015 et plus précisément à l'axe 2 à travers une approche interdisciplinaire sur "les risques sur la santé face aux changements globaux" en apportant des connaissances utiles à une politique intégrative de santé publique. Le projet OCEAN-15 est divisé en quatre tâches majeures qui abordent divers aspects de l’écologie chimique d’O. cf. ovata : (1) l'étude de son métabolisme spécialisé, (2) les effets du changement global sur ce métabolisme, (3) les impacts écologiques de ce métabolisme, et (4) les effets et mécanismes liés à la toxicité de ces métabolites spécialisés sur l’homme.
Une approche collaborative et multidisciplinaire permettra d'atteindre les objectifs proposés. Dans ce projet, nous combinerons des expertises issues de certains groupes de recherche référents dans les domaines de l'écologie chimique et de la métabolomique marines (1-ICN), la chimie des phycotoxines et l'écotoxicologie (3-IFREMER), l'écologie phytoplanctonique (2-LOV) et la toxicologie humaine (4-ANSES). L'aptitude et la complémentarité de ce consortium a été révélée à travers la participation conjointe de certains ou tous les partenaires aux GDR CNRS Mediatec et Phycotox mais aussi à des initiatives internationales (International Society for the Study of Harmful Algae). Ainsi nous sommes convaincus que les données obtenues dans ce projet seront utiles à la société car elles aideront à assurer un suivi des efflorescences algales et de leurs impacts sur les côtes méditerranéennes touristiques.