DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

Vers la prévention de dysfonctions vasculaires et la délivrance de médicaments au travers des endothelia – TransEndotheliaTunnel

TransEndotheliaTunnel

Nous avons découvert des tunnels transcellulaires endotheliaux dépendant du cytosquelette d’acto-myosine sous la dépendance d’un phénomène cellulaire de démouillage. Nous avons d’identifié des paramètres biochimiques et biophysiques résistant à des cycles d’ouvertures/fermetures. Nous proposons d’identifier des molécules contrôlant l’extension/fermeture de ces tunnels. L’hypothèse du démouillage cellulaire implique un mécanisme de sensibilité à la courbure membranaire que nous voulons dévoiler.

Enjeux et objectifs

Les questions principales soulevées par nos précédents résultats concernent : (1) la fonction de l'anneau d'acto-myosine en relation avec l'élévation de la tension de ligne déduite de la théorie de démouillage cellulaire qui explique la formation de tunnels transcellulaire de taille limitée ; (2) comment se forme l'actomyosin au niveau d'une nouvelle courbure membranaire et (3) comment MIM pilote le recrutement et l'activation d'Arp2/3 et l'effet de domaines I-BAR sur la tension de membrane. <br />Nous proposons donc de cibler les objectifs suivants : (1) identifier les acteurs cellulaires influençant la taille maximale des TEM ; (2) de caractériser les partenaires interagissant avec l'anneau d'actomyosine et qui contrôle l'extension/fermeture des TEM ; (3) de dévoiler comment la cellule est sensible à la courbure membranaire et (4) de développer un dosage pour une approche par criblage à haut-débit.

Notre projet est multidisciplinaire avec la mise en oeuvre d'approches en imagerie (y.c. microscopie photonique de super-résolution), biophysiques (y.c. spectroscopie de force en microscopie à force atomique, ablation laser, micromanipulation (micropipettes et pinces optiques) sur des vésicules géantes et des nanotubes de membrane) et l'utilisation de méthodes de criblage par imagerie à haut-débit et haut-contenu dans un contexte d'intoxication de cellules endothéllales par des toxines d'origine bactérienne (EDIN de S aureus et oedéma factor de l'anthrax). Il possède également un volet théorique avec le développement d'un cadre théorique prenant en compte les résultats expérimentaux obtenus.

l'endothélium assure une fonction vitale de barrière semi-perméables protectrice pour les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Les pathogènes et leucocytes peuvent traverser cette barrière en ouvrant de larges ouvertures décrites comme des macro-ouvertures transendotheliaux (TEM) qui sont formés par contact et hémifusion des membranes apicales et basales. Ces tunnels s'ouvrent transitoirement. Nous avons fait des progrès significatifs dans la définition des principes physiques qui gouvernent l'ouverture des TEMs, le contrôle de leur taille par une réorganisation autonome du cytosquelette d'actomyosine couplé à une théorie physique et débuter l'identification de nouveaux régulateurs contrôlant leur fermeture et taille maximale. Nous avons établi les conditions pour un criblage chimique de composés interférant avec la dynamique d'ouverture/fermeture.
Nous avons identifié que l'ezrin augmente la tension de ligne le long des limites des tunnels via la formation de câble d'actomyosine dépendant de NMIIa (article commun en révision à Nat Comm). La théorie du démouillage cellulaire prédit qu'une tension d'origine inconnue agit à la bordure des TEMs pour limiter leur ouverture. Grâce à une approche basée sur l'analyse en super-résolution, nous avons dévoilé la présence d'un câble d'actomyosine entourant les TEMs. Nous avons développé un cadre théorique physique pour interpréter les paramètres physiques qui ont été déterminés de façon quantitative par des expérience d'ablation laser. Ceci a permis d'établir un rôle critique de l'ezrin et de la myosine II non-musculaire (NMII) dans l'implémentation progressive de la tension de ligne. L'ezrin agit en amont sur la formation de l'anneau en le stabilisant en bordure du tunnel en favorisant leur interactions croisées avec NMIIa. Nos résultats confèrent à l'ezrin et à NMIIa une fonction de contrôle de la tension de ligne à la bordure des TEMs en favorisant la formation d'un anneau d'actomyosine.

Nous avons développé un cadre théorique, le démouillage cellulaire, qui permettent d'interpréter les paramètres physiques grâce à des expériences d'ablation laser. Ceci nous a permis de déterminer que l'Ezrin et NMIIa augmentent la tension de ligne à la périphérie des TEMs en promouvant la formation d'un anneau d'acto-myosine. En analysant nos résultats expérimentaux dans le cadre du démouillage cellulaire, nous montrons que la taille des TEMs est restreinte par l'organisation de cet anneau. Celui-ci développe une tension de ligne, fixant la taille maximale du TEM. D'un point de vue mécanique, nous proposons que l'ezrin, en stabilisant le filament d'actine autour du TEM favorise la formation de faisceaux d'actine en un câble rigide d'une façon dépendante de NMIIa. Si ce processus de contrôle de la taille des TEMs est perturbé l'ouverture ne cesse de grandir jusqu'à rompre l'intégrité de la cellule. Ceci confère à l'ezrin une fonction de contrôle de l'intégrité des cellules endothéliales.
L'ezrin est l'une des protéines membranaires les plus abondantes. Elle lie l'actine à la membrane plasmique. Comme elle est enrichie sur les structures incurvées comme la limite des TEMs et les filopodes, nous avons étudié si elle avait des capacités de senseur de courbure. Nous n'avons pas trouvé de preuve en ce sens pouvant expliquer l'instabilité à la limite des TEMs. Par contre, nous l'avons observé enrichie sur les membranes fortement incurvées de par son interactions avec les domaines I-BAR.
Nous avons réussi à induire la formation de TEMs en absence de toxines ou de drogues, en indentant la cellule avec une pointe AFM. Ces expériences miment l'action de podosomes durant la diapédèse leucocytaire. Cela confirme l'action protectrice de l'actine corticale contre la formation spontanée des TEMs dans les cellules non intoxiquées.

Contractile actin cables induced by Bacillus anthracis lethal toxin depedent on the histone acetylation machinery (Rolando, Stefani, Doye, Acosta, Visvikis, Yevick, Buchrieser, Mettouchi, Bassereau Lemichez) Cytoskeleton 2015 542:56.

-RSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along memebrane tubes (Prévost, Zhao, Manzi, Lemichez, Lappalainen, Callan-Jones, Bassereau) Nat. Commun 2015 15,6:8529.

-Ezrin powers line tension via NMIIa-driven actomyosin cable formation along transcellular tunnel edges (Stefani, Gonzalez-Rodriguez, Senju, Doye, Efimova, Lipuma, Hamaoui, Maddugoda, Cochet-Escartin, Prévost, Janel, Lafont, Svitkina, Lappalainen, Bassereau, Lemichez) Nat. Commun. (in revision)

Force-induced transcellular tunnel formation in endothelial cells (Ng, Webster, Stefani C, Schmid, Lemichez, Bassereau, Fletcher) Mol. Biol. Cell (submitted)

Microbial pathogenesis meets biomechanics (Charles-Orszag, Lemichez, Tran Van Nhieu, Duménil) Curr Opin Cell Biol 38:31-7 (2016)

Nous avons découvert un phénomène biophysique d'ouverture transitoire de larges tunnels transcellulaires (TEM pour “transendothelial cell macroaperture”) dans les cellules endothéliales qu'induit la relaxation du cytosquelette d'actine et que nous avons nommé "démouillage cellulaire". Nos travaux montrent qu'à la différence du démouillage d’un liquide, les cellules sont capables de limiter l’ouverture de ces tunnels par formation d'un anneau d'actomyosine et de promouvoir leur fermeture par la formation de voiles cytoplasmiques sous contrôle de la protéine à domaine I-BAR MIM. Nos travaux antérieurs nous ont permis de caractériser les premiers acteurs moléculaires et aspects biophysiques contrôlant les cycles d’ouvertures/fermetures. Nos travaux publiés et non-publiés ont aussi permis d'identifier des facteurs régulateurs et voies de signalisation critiques de la dynamique des TEMs. D’autre part, notre modèle physique de démouillage cellulaire implique un mécanisme de perception et régulation du cytosquelette d'actomyosine par la courbure membranaire que nous voulons étudier dans ce projet. Nous réaliserons un criblage original de composés chimiques modulateurs de l’ouverture/fermeture des tunnels transcellulaires dans le but de contrôler la perméabilité vasculaire. Ce mode d’ouverture transitoire de tunnels transcellulaires est exploité par des leucocytes pendant la diapédèse et est usurpé par certains pathogènes pour moduler la barrière endothéliale et promouvoir la formation de métastases septiques. L'absence de fermeture des TEM est associée à des hémorragies massives. Nous avons la preuve génétique que les toxines produisant des TEM sont des facteurs invasifs des Staphylocoques dorés. La définition des risques infectieux associés à la présence de ce type de facteurs est importante pour anticiper ces formes mortelles d’infection. Nous avons aussi engagé des investigations sur la caractérisation d'haplotypes chez des cohortes de patients atteints de thrombose veineuses et de saignements inexpliqués possiblement corrélés avec la formation de tunnels. La recherche de mutants et d'haplotypes possédant des défauts des régulateurs de la dynamique des TEM permettra de développer des outils de diagnostiques pour le développement d'une médecine personnalisée. La manipulation de la dynamique des TEM, nous permettra de cribler de nouvelles générations de composés modulateurs de la perméabilité vasculaire.

L'ensemble de ce programme sera réalisé par un consortium interdisciplinaire de scientifiques possédant des expertises complémentaires en imagerie, signalisation cellulaire, biologie vasculaire, microbiologie, biophysique, clinique, et informatique. F Lafont (coordinateur) est expert dans les interactions hôte-pathogènes et la mécanique cellulaire utilisant la microscopie à force atomique couplée à la microscopie de fluorescence. E Lemichez (Partenaire 2) est expert du mode d’action des toxines bactériennes ciblant l'endothélium. P Bassereau (Partenaire 3) est experte de la physique des cellules, spécialement dans l’établissement et l’analyse de modèles membranaires biomimétiques.

Nous devrions obtenir des résultats significatifs permettant la publication dans des journaux à comité de lecture à haut facteur d’impact, ainsi qu'au dépôt de brevets et potentiellement de soutenir l’activité de spin-off. Nos résultats auront un impact sur les dysfonctions vasculaires. Notre projet en rupture avec les concepts classiques de contrôle de la perméabilité vasculaire nous permettra de répondre à des questions importantes au-delà du domaine de l’infection. Nos résultats pourraient mettre en évidence des mécanismes moléculaires impliqués dans diverses maladies humaines liées aux dysfonctions vasculaires, bactériémie, infections métastatiques, oedèmes, formes idiopathiques de saignements spontanés ou provoqués et pathologies rénales.

Coordinateur du projet

Monsieur Frank LAFONT (Centre d'Infection et d'Immunité de Lille)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

INSTITUT CURIE - SECT DE RECHERCHE
CNRS Centre d'Infection et d'Immunité de Lille
INSERM INSERM DR PACA ET CORSE

Aide de l'ANR 388 960 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2015 - 36 Mois

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