Validation de MT5-MMP comme nouvelle cible thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer et mécanismes d'action – MAD5

Nous utilisons différents modèles de cellules en culture : i) des cellules HEKswe ou des cellules de neuroblatoma humain SH-SY5Y porteuses d’une la mutation familiale Swedish ; ii) des cultures de neurones/astrocytes primaires issues de souris transgéniques 5xFAD et souris 5xFAD déficientes en MT5-MMP ; iii) des cellules neurales humaines dérivées de cellules souches induites a la pluripotence (iPS).
Nous utilisons comme modèle in vivo essentiellement les souris transgéniques 5xFAD qui récapitulent les traits fondamentaux de la maladie, à savoir : accumulation progressive d’Aß soluble/oligomérique et fibrillaire, gliose réactive accompagnée d’une augmentation des taux de médiateurs pro-inflammatoires, déficits cognitifs, émotionnels et moteurs, synaptotoxicité et mort neuronale dans le cortex et l’hippocampe.
Techniques biochimiques et de biologie moléculaire incluant : clonage de gènes et construction de séquences d’ADNc pour insertion dans des plasmides d’expression et/ou des vecteurs lenti/adenoviraux, transfection stable ou transitoire dans nos modèles cellulaires de ces constructions, expression de gènes par qPCR, contenu de protéines par immunoblot et ELISA, analyse d’interactions protéiques par immunoprécipitation et le système VENUS.
Marquages immunohistochimiques et immunocytochimiques à l’aide d’anticorps et de la microscopie confocale et ou super-resolutive, suivi de l’analyse d’image à l’aide d’Imaris (e.g., analyse morpho-quantitatif des épines dendritiques), analyse du trafique intracellulaire à l’aide de marqueurs de différents composantes du système endosomal/lysosomal.
Analyse de l’activité neuronale sur des cultures de neurones primaires de cerveau de souris et des cultures de neurones humaines issues de cellules iPS par la technique de patch-clamp en configuration de cellule entière.

- Evidence des effets délétères de MT5-MMP in vivo dans le cortex frontal, une zone du cerveau également affectée dans la MA, qui élargie les observations faites antérieurement dans le même sens au niveau de l’hippocampe et du néocortex. Un article a été publié (Baranger et al., 2017).
- L’expression transitoire MT5-MMP dans un système hétérologue stimule le trafic de l’APP vers les endosomes précoces, siège de l’amyloïdogenèse, ainsi que la production d’Aß. Ces résultats font partie également de l’article Baranger et al., (2017).
- L’absence de MT5-MMP est neuroprotectrice à un stade avancée de la pathologie chez la souris Tg (12 mois) suite à une analyse stéréologique. Ceci s’accompagne d’une moindre accumulation d’Aß fibrillaire et aussi oligomérique de petite taille à différents stades de la pathologie.
- L’absence de MT5-MMP dans des cultures de neurones/astrocytes diminue la réponse à l’IL-1ß, suggérant un lien fonctionnel entre la cytokine et la protéase.
- Développement de vecteurs lenti/adénoviraux codant pour des fragments d’APP générés suite au clivage de MT5-MMP, pour étudier leurs activités potentiellement cytotoxiques. A présent seulement le fragment ?-CTF serait cytotoxique.
- Développement de lignées de cellules iPS issues d’individus sains et de patients Alzheimer que nous avons ensuite différencié en neurones. Nous avons également introduit des délétions et des mutations inactivantes pour MT5-MMP dans ces iPS à l’aide de CRISPR/Cas9.

Continuer à étudier les interactions fonctionnelles entre MT5-MMP et IL-1ß, notamment via la possible interaction entre MT5-MMP et des ubiquitine ligases activée lors de la signalisation IL-1ß. Nous étudierons si l’absence de MT5-MMP peut influencer l’effet à priori perturbateur de la cytokine sur l’activité synaptique, sur la base de nos résultats préliminaires. Nous utiliserons des cultures de neurones issues de souris génétiquement modifiées MT5-MMP-/-, ainsi des neurones issues de cellules iPS délétées/inactivées pour MT5-MMP pour déterminer comment ces interactions entre MT5-MMP et IL-1ß affectent le métabolisme de l’APP/Aß, la réponse inflammatoire et l’activité synaptique. L’injection ICV d’IL-1ß nous permettra d’évaluer si la déficience en MT5-MMP interfère également avec la signalisation IL-1ß in vivo.
Etudier quels sont les domaines de MT5-MMP interagissent avec l’APP (et d’autres membres de la cascade amyloïde, eg., nicastrine) et les conséquences fonctionnelles, à l’aide des constructions lentivirales générées. Nous évaluerons l’impact sur le métabolisme et trafic de l’APP et la réponse inflammatoire dans nos cultures de neurones murines et humaines.
Nous avons entrepris la conception d'AAV et de lentivirus exprimant les fragments de ßAPP obtenus par la ?-sécrétase. Ces vecteurs permettront d'examiner l'influence des fragments liés à la ?-sécrétase in vivo après injection ICV, ainsi que dans les neurones primaires en culture, aussi bien sur leur viabilité que sur leurs réponses électrophysiologiques. L'AAV peut être utilisé au stade néonatal et permettre de suivre la toxicité intrinsèque chez les souris naïves et aussi transgéniques Alzheimer, afin d’évaluer l'influence putative des fragments ? avant ou après une lésion donnée (plaques, enchevêtrements, perte synaptique).

Publications internationales à comité de lecture
1. Baranger et al., 2017. Frontiers in Molecular Neuroscience doi: 10.3389/fnmol.2016.00163.

Communications (Conférence)
S. Rivera. MT-MMPs new actors and potential targets in Alzheimer’s disease. Gordon Research Conference on Matrix Metalloproteinases, University of New England, Biddeford ME, USA. July 9-14, 2017. Conférence invitée.

K Baranger, A Bonnet, S Girard, JM Paumier, L Garcia-Gonzalez, W Elmanaa, D Stephan, A Bernard, C Bauer, E Charrat, K Moschke, S Lichtenthaler, F Roman, F Checler, M Khrestchatisky and S Rivera. MT5-MMP promotes amyloidogenesis, neuroinflammation and cognitive decline related with the frontal cortex in 5xFAD mice. The 13th International Conference on Alzheimer's & Parkinson's diseases. Vienne, Autriche. 2 Avril 2017. Oral communication.

S. Rivera, A. Bonnet, JM Paumier, N Crouzin, L Garcia Gonzalez, A Carrete, A Bernard, M Vignes, S Lichtenthaler, F Checler, M Khrestchatisky, K BarangerMT5-MMP, a new potential therapeutic target in Alzheimer’s disease. 52nd International Conference on Medicinal Chemistry, July 6-8, 2016 | CAEN, Normandy, France. Conférence invitée.

Notre objectif global est de mieux comprendre certaines des voies protéolytiques opérant dans l’amyloïdogenèse et la neuro-inflammation, des processus clés de la neurodégénérescence et le déclin cognitif dans la maladie d'Alzheimer (MA). La MA est la maladie neurodégénérative la plus dévastatrice avec un fardeau socio-économique majeur qui est accentué par l'absence de traitements efficaces. Malgré une variété de thérapies actuellement à l'étude, la découverte d'un remède ne semble pas être à la portée à ce stade. Il y a donc urgence à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et à améliorer notre compréhension des mécanismes phsyiopathologiques sous-jacents. C’est dans ce contexte que le projet de MAD5 cherche à établir des liens fonctionnels entre l’amyloïdogenèse et à la neuro-inflammation dans les différents stades de la maladie. À cette fin, deux laboratoires du CNRS de Marseille et Sophia-Antipolis, leaders dans leurs domaines respectifs et avec des compétences complémentaires, ont uni leurs forces pour développer le projet MAD5 dans le cadre d'une collaboration déjà existante. Ensemble, nous avons généré ces trois dernières années des données préliminaires qui ont été soumises pour publication et qui constituent la base de MAD5. Nous avons ainsi, démontré, dans des modèles cellulaires et in vivo de la MA, en particulier dans des souris transgéniques (Tg), qu'une métalloprotéinase matricielle M(MP) contribue au clivage amyloïdogénique de la protéine précurseur de l'amyloïde (APP), ainsi qu’à la réponse pro-inflammatoire associée. Cela nous pousse à émettre l'hypothèse que cette MMP pourrait contribuer à la pathogenèse de la MA et donc être une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Afin de valider davantage ces hypothèses et mieux comprendre les mécanismes d'action sous-jacents, nos objectifs spécifiques sont les suivants:
1. Évaluer l'impact de la déficience en cette MMP sur la pathogenèse et le déclin cognitif chez des souris qui développent certains symptômes de la MA.
2. Évaluer l'impact de la déficience en cette MMP sur la neuro-inflammation et les mécanismes d'action sous-jacents.
3. Évaluer les interactions fonctionnelles de cette MMP avec l’APP et d’autres éléments clés du processus amyloïdogénique.

La principale originalité de MAD5 est que nous dévoilons un nouvel élément important du puzzle protéolytique qui ouvre de nouvelles voies de recherche sur les mécanismes de pathogenèse dans la MA. Ces voies peuvent être complémentaires et / ou alternatives à celles classiquement étudiées jusqu'à présent.

L'impact attendu de MAD5: 1) Identifier de nouvelles voies moléculaires qui contribuent à la pathogenèse, et conduire à terme à des stratégies thérapeutiques innovantes sans les effets secondaires des inhibiteurs traitements actuels à l'étude. 2) Identifier cette MMP comme une protéase importante dans le métabolisme de l’APP qui devrait nous aider à mieux comprendre le rôle amyloïdogénique de l'APP. 3) Améliorer notre connaissance des interactions entre neuro-inflammation et amyloïdogenèse, qui est encore une question majeur non résolue dans la MA. 4) Identifier un nouvel axe de signalisation moléculaire qui pourrait être cruciale pour la compréhension de la neuro-inflammation dans la MA et d'autres maladies neurodégénératives. 5) Mettre en œuvre et valider des outils moléculaires qui pourraient être utilisés en tant que modèles pour des agents susceptibles de modifier l'activité / interactions de la MMP objet d'étude.
À tous les égards, et à notre connaissance, MAD5 a peu de concurrents dans le monde à ce stade, et notre consortium est idéalement placé pour mener des recherches actuelles et futures sur la validation d'une nouvelle cible thérapeutique prometteuse dans la MA.