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Publication du programme PAUSE – ANR Ukraine pour l’accueil de scientifiques ukrainiens et ukrainiennes dans des laboratoires français
DS0402 - Décryptage des fonctions biologiques élémentaires et de leur intégration

Voies métaboliques glycosomales non glycolytiques: nouvelles fonctions pour le développement et la virulence des trypanosomes – GLYCONOV

GLYCONOV - Voies métaboliques non glycolytiques dans les glycosomes: nouvelles fonctions pour le développement et la virulence du trypanosome

Les trypanosomatidés sont des parasites transmis par des insectes vecteurs responsables de maladies humaines majeures, qui représentent ~24 millions de personnes infectées dans le monde. Cependant, il n’existe aucun vaccin et peu de médicaments ont été développés. Les particularités biologiques développées par ces parasites, telles que les voies métaboliques glycosomales étudiées dans GLYCONOV, constituent de nouvelles cibles potentielles pour le développement de nouveaux médicaments.

Vers l'identification de nouvelles fonctions de voies métaboliques glycosomales peu ou pas explorées chez les trypanosomes

Les trypanosomes ont un métabolisme intermédiaire très atypique, incluant des voies métaboliques particulières localisées dans les glycosomes, des organites de type peroxisome contenant principalement des enzymes glycolytiques. GLYCONOV est un projet original portant sur les voies métaboliques glycosomales non glycolytiques inexplorées ou peu explorées pour lesquelles les partenaires GLYCONOV anticipent de nouveaux rôles dans le développement et les interactions du parasite avec ses hôtes (les mammifères réservoirs dont l'homme, et la mouche tsétsé, l'insecte vecteur). Ce projet visant à élucider le rôle de trois voies métaboliques glycosomales dans les formes de l'insecte vecteur (PCF) et de l'hôte mammifère (BSF) de Trypanosoma brucei est divisé en 4 tâches. La tâche 1 consiste à analyser le(s) rôle(s) de la néoglucogenèse et du métabolisme du glycérol lors du développement cyclique des trypanosomes dans la mouche tsétsé. Dans la Tâche 2, nous étudions le lien entre l'IDHg glycocomale et le métabolisme des éther-lipides dans les PCF. En effet, nous avons montré que l'IDHg est essentielle pour le développement du parasite dans la mouche tsétsé et pour la différenciation in vitro des PCF en formes métacycliques. La Tâche 3 traite de la biosynthèse des sucres nucléotidiques, qui sont considérés comme synthétisés dans les glycocomes des trypanosomes, bien que nos données non publiées suggèrent que la voie conduisant à l'UGP-glucose, produite par une UDP-glucose pyrophosphatase (UGP), est active dans le cytosol au lieu des glycosomes. Dans la Tâche 4, nous étudions également le rôle de ces trois voies métaboliques dans les formes sanguines des trypanosomes (BSF).

Le but de GLYCONOV est d'avoir une compréhension complète du rôle de 3 voies métaboliques glycosomales, à la fois chez les formes PCF et BSF de T. brucei, qui ont été démontrés par les partenaires GLYCONOV comme étant essentiels à la viabilité des trypanosomes au cours du développement la mouche tsé-tsé (insecte vecteur). Ceci sera réalisé en générant des lignées cellulaires mutantes (RNAi, knockout, expression de protéines étiquetées ou mutées, etc.) pour les étapes enzymatiques clés de ces voies. En outre, un nombre important de mutants est déjà disponible dans notre réseau (> 100 ont été produits jusqu'à présent) et certains d'entre eux seront également analysés avec les nouveaux outils développés par les partenaires de GLYCONOV. Ces mutants seront analysés à l'aide d'un certain nombre d'approches qualitatives et quantitatives à la pointe de la technologie incluant (i) les approches métabolomiques (RMN et IC-MS/MS), lipidomique et protéomique, (ii) la différenciation in vitro dans un nouveau Modèle de différenciation basé sur l'expression de RBP6, et (iii) analyses in vivo du développement du parasite dans les modèles de mouche tsé-tsé et de souris.

1- Nous avons caractérisé en détails la nature de la répression catabolique exercée par le glycérol sur le métabolisme du glucose. Cette répression résulte d'une compétition pour l'ATP glycosomal entre l'HK (1ère étape de la glycolyse) et la GK (1ère étape de la dégradation du glycérol), qui est en très large excès.
2- Nous avons identifié 3 voies différentes (2 avérées et une en cours d'analyse) pour la synthèse du fructose 6-phosphate via la néoglucogenèse, i.e. la FBPase, la réversion de la PFK et probablement la SBPase (en cours d'analyse).
3- Contre toute attente, l'IDH glycosomale (IDHg) accepte aussi bien le NAD+ que le NADP+ comme cofacteur; l'IDHg a été cristallisée pour comprendre son activité enzymatique et son rôle dans les glycosomes (publié dans Protein Expr. Purif.).
4- En marge de cette tâche, nous avons caractérisé les sources de carbone utilisées pour la biosynthèse des lipides, les voies métaboliques concernés, les régulations de flux métaboliques entre ces différentes voies et leur rôle in vivo dans l'insecte vecteur (en révision dans PLoS Pathog.).
5- Lorsque surexprimée dans les glycosomes, l'UGP n'est pas active, alors qu'elle est active dans le cytosol, ce qui est en faveur de notre hypothèse, i.e. la voie métabolique correspondant est active uniquement dans le cytosol.
6- Lorsque les BSF sont cultivées en présence de glycérol mais sans glucose, la GK et surtout la FBPase sont essentielles à la croissance, montrant que les formes sanguines effectuent la néoglucogenèse à partir du glycérol.
7- Par ailleurs, deux revues portant sur le métabolisme des trypanosomes ont été publiées dans F1000 Res. et Int. J. Biochem. Cell. B, et le Partenaire 1 est co-auteur de 2 Articles publiés dans PLoS Pathog. et Mol. Biochem. Parasitol. sur le rôle du métabolisme de la proline in vivo dans l'insecte vecteur, et le rôle de la NADH dehydrogénase dans le métabolisme des formes sanguines, deux aspects du métabolisme énergétique liés au projet GLYCONOV.

Ce projet contribuera certainement à accroître les connaissances sur les voies métaboliques inhabituelles rencontrées dans les glycocomes des trypanosomatidés (néoglucogenèse et métabolisme du glycérol - Tâche 1, biosynthèse du sucre nucléotidiques - Tâche 3), ainsi que des voies également présentes dans les peroxisomes d'autres eucaryotes (IDHg et biosynthèse des éther-lipides - Tâche 2), qui n'ont été que peu étudiées jusqu'à présent. En effet, un certain nombre de processus atypiques ont d'abord été découverts dans le modèle trypanosome avant d'être trouvés ou compris dans d'autres eucaryotes, tels que l'édition d'ARN, l'interférence ARN (RNAi), etc. Nous prévoyons que ces découvertes contribueront de manière significative à la compréhension du métabolisme non-glycolytique glycosomal dans les stades parasitaires de l'insecte vecteur (PCF) et de l'hôte mammifère (BSF) de T. brucei, ainsi que le métabolisme peroxysomal d'autres organismes eucaryotes.

Articles publiés
1. Bringaud F., T.K. Smith, D.P. Nolan & L.M. Figueiredo (2017) Metabolic changes during the Trypanosoma brucei life cycle. F1000Res. Sous presse
2. Wang X, Inaoka D.K., Shiba T., Balogun E.O., Allmann S., Watanabe Y.I., Boshart M., Kita K. & Harada S. (2017) Expression, purification, and crystallization of type 1 isocitrate dehydrogenase from Trypanosoma brucei. Protein Expr. Purif. 5928:30314-5.
3. Allmann S. & F. Bringaud (2017) Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in T. brucei. Int. J. Biochem. Cell. B. 85:85-90
4. Suárez Mantilla B., L. Marchese, N.A. Dyer, N. Ejeh, M. Biran, F. Bringaud, M.J. Lehane, A. Acosta-Serrano & A. Silber (2017) Trypanosoma brucei proline metabolism is essential for colonization of the tsetse. PLoS Pathog. 13:e1006158
5. Surve S.V., B.C. Jensen, M. Heestand, M. Mazet, T.K. Smith, F. Bringaud, M. Parsons & A. Schnaufer (2016) NADH dehydrogenase of Trypanosoma brucei is important for efficient acetate production in bloodstream forms. Mol. Biochem. Parasitol. 211:57-61

Les trypanosomatidés sont des protozoaires parasites transmis par des insectes vecteurs et responsables de maladies humaines majeures, qui représentent ~24 millions de personnes infectées dans le monde, avec plus de 600 millions de personnes à risque. La maladie du sommeil, causée par Trypanosoma brucei, est une maladie mortelle en l’absence de traitement. Cependant, il n’existe aucun vaccin, les médicaments existants ont des effets secondaires graves (voire létaux) et le nombre de cas de résistance aux médicaments augmente considérablement. Des problèmes similaires se présentent pour la maladie de Chagas (T. cruzi) et les leishmanioses (Leishmania spp.). Les trypanosomatidés sont également connus pour leurs particularités biologiques, génétiques et métaboliques, et se sont imposés comme microorganismes modèles suscitant un intérêt scientifique d’ordre plus général. Parmi les nombreux mécanismes exotiques développés par ces parasites, plusieurs voies métaboliques atypiques ont été mises en évidence, telles que certaines voies glycosomales. Ces processus biologiques peu conventionnels sont également considérés comme des cibles potentielles pour le développement de nouveaux médicaments. Les glycosomes sont des organites apparentées aux peroxysomes, essentiellement composés d’enzymes de la glycolyse (jusqu'à 90% de leur contenu). Bien que la glycolyse ait été largement étudiée, peu de choses sont connues sur les autres voies métaboliques glycosomales, telles que leur expression, topologie, régulation, interaction(s) avec d’autres compartiments sub-cellulaires, rôles dans le développement et la virulence, etc.

Notre projet concerne principalement l'analyse de voies métaboliques non conventionnelles localisées dans les glycosomes des trypanosomatidés, en utilisant comme modèle T. brucei. Ce trypanosome africain est devenu le modèle de choix pour étudier ce groupe de parasites, depuis le développement de l’interférence ARN (ARNi). GLYCONOV est un projet de recherche fondamentale avec des applications potentielles visant à caractériser de nouvelles voies métaboliques récemment mises en évidence par les partenaires de GLYCONOV. Trois voies métaboliques seront étudiées d’abord dans un stade parasitaire de l’insecte en culture (PCF), puis in vivo au cours du développement dans la mouche tsétsé, et enfin dans les stades sanguins du mammifère (BSF).

Depuis 2002, les partenaires de GLYCONOV ont apporté une contribution importante à l'analyse des différentes voies et enzymes du métabolisme intermédiaire et énergétique de T. brucei, en particulier la voie glycosomale conduisant à l'excrétion de succinate et la pyruvate phosphate dikinase qui participe au maintien de la balance ATP/ADP glycosomale des PCF. Les partenaires de GLYCONOV ont également récemment révisé le métabolisme central des BSF en mettant en évidence des voies métaloliques essentielles inattendues, dont certaines sont glycosomales. Le but de ce projet est de déterminer le rôle de trois voies métaboliques glycosomales peu ou pas étudiées, récemment mis en évidence par les partenaires de GLYCONOV, i.e. la néoglucogenèse et le métabolisme de glycérol (Tâche 1), le métabolisme du NADPH liant l’isocitrate déshydrogénase à la biosynthèse des éthers lipides (Tâche 2) et la biosynthèse des sucres nucléotidiques (Tâche 3), et ce dans les PCF ainsi que dans les BSF, à la fois in vitro et in vivo (Tâche 4). Notre réseau présente l’avantage de combiner des expertises complémentaires pour produire (RNAi et/ou knockout) et étudier (métabolomique, protéomique, analyse in vivo dans l’insecte et la souris, différentiation in vitro, etc.) des mutants d’enzymes glycosomales en tirant profit d’une collection de mutants affectant les principales étapes du métabolisme de ce parasite (>100). GLYCONOV contribuera à comprendre la fonction biologique de cet organite énigmatique et mettra l'accent sur de nouvelles enzymes essentielles qui pourraient être ciblées pour lutter contre la maladie du sommeil.

Coordinateur du projet

Monsieur Frédéric BRINGAUD (Laboratoire de Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

LMU Ludwig-Maximilians-Universität Munchen
LBM Laboratoire de Biogenèse Membranaire
IP INSTITUT PASTEUR - Unité de Biologie Cellulaire des Trypanosomes
MFP Laboratoire de Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité

Aide de l'ANR 597 000 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2015 - 48 Mois

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