Influence des interactions avec le Soi sur le devenir des cellules T CD4 naïves en phase effectrice – Self-shaped-CD4_TN

Ce projet est divisé en quatre parties distinctes:
• Le premier objectif se concentrera sur les interactions des CD4 TN avec leurs partenaires cellulaires dans les organes lymphoïdes secondaires. Nous observerons si elles varient en fonction du degré d'auto-réactivité des CD4 TN. Pour cela, nous documenterons la localisation des CD4 TN Ly-6C- et Ly-6C+ dans les ganglions lymphatiques par microscopie par immunofluorescence. Les interactions productives seront visualisées et quantifiées grâce à l'observation de flux calciques intracellulaires ou de la translocation nucléaire du facteur de transcription NFAT.
• Le deuxième objectif est construit sur nos données préliminaires récentes démontrant qu'une augmentation intracellulaire soutenue de calcium est suffisante pour induire la conversion phénotypique de CD4 TN Ly-6C+ en leurs homologues Ly-6C-, par une voie dépendante de Calcineurine (CN). La signature transcriptionnelle de ces sous-populations lymphocytaires sera déterminée, comme ses composants dépendants du calcium et de la CN. Cette analyse nous donnera des informations clés sur les gènes régulés par le ‘tonic TCR signaling‘ dans les CD4 TN.
• Le troisième objectif est d'identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans le potentiel de différenciation en iTreg supérieur des CD4 TN Ly-6C-. Nous documenterons dans un premier temps l'activation des voies de signalisation en analysant l'état de phosphorylation des molécules clés à différents temps lors de la différenciation en iTregs de ces deux types cellulaires. Parallèlement, les gènes candidats identifiés comme dépendant à la fois de l'auto-réactivité et de la signalisation calcium / CN (Objectif n ° 2) seront testés pour leur influence sur la génération de cellules iTreg.
Enfin, le quatrième objectif visera à valider in vivo les résultats des trois premières tâches. Nous étudierons la possibilité de moduler la génération de cellules iTreg in vivo dans trois modèles expérimentaux.

Nous nous sommes concentrés sur les mécanismes moléculaires impliqués dans le modelage par le Soi du compartiment des CD4 TN. Nous avons comparé le profil transcriptomique des 2 sous-populations de CD4 TN définies par l'expression de Ly-6C. L'analyse approfondie de ces profils confirme le rôle de la voie de signalisation du TCR dans la signature moléculaire des CD4 TN les plus auto-réactives (Ly-6C-). Nous avons ensuite identifié la cascade de signalisation calcium-calcineurine comme clé pour l'acquisition à la fois du phénotype des CD4 TN Ly-6C- et de leur capacité intrinsèque élevée à s’orienter dans la voie de différenciation en cellules T régulatrices induites lors de leur activation in vitro et in vivo.
Cette polarisation biaisée des CD4 TN les plus autoréactives à s'engager dans la lignée des iTreg peut représenter un mécanisme efficace d'autorégulation. En effet, cela réduirait le risque pour un clone de CD4 TN autoréactif de se différencier en effecteurs délétères lors d'une réponse immunitaire. Le rôle crucial de la cascade de signalisation calcium-calcineurine dans ce processus d'éducation pourrait par ailleurs être pris en compte. En effet, nous montrons qu’un traitement chronique avec un inhibiteur de la calcineurine conduit à la disparition des CD4 TN Ly-6C-. Ces inhibiteurs, largement utilisés chez les patients transplantés, pourraient ainsi interférer avec la néoconversion des CD4 TN en iTreg. Cela pourrait potentiellement limiter l'établissement d'une tolérance efficace vis-à-vis d’un greffon et expliquer la difficulté à interrompre en toute sécurité ces thérapies immunosuppressives, même après des années. Ainsi, en plus de leur utilité clinique évidente, les inhibiteurs de calcineurine peuvent avoir des effets secondaires potentiellement nocifs qui devraient être étudiés pour mieux évaluer et adapter leur utilisation.

Le phénotype des CD4 TN les plus auto-réactives est maintenu dans le temps grâce à des interactions chroniques avec des molécules du Soi. Nous nous concentrerons sur l'identification des partenaires du ‘tonic TCR signaling’ des CD4 TN (Ly-6C-). Pour atteindre cet objectif, nous analyserons d'abord la distribution des lymphocytes T CD4 Ly-6C- et Ly-6C+ dans les organes lymphoïdes secondaires à l'état basal. Comme des expériences de chimères de la moelle osseuse indiquent que les cellules exprimant le CMH-II sont nécessoire au maintien du phénotype des CD4 TN Ly-6C-, nous concentrerons nos efforts sur les cellules d'origine hématopoïétique.
Les ganglions lymphatiques sont des organes lymphoïdes en forme de haricots encapsulés qui sont divisés en trois régions principales: le cortex, le paracortex et la medulla. Les lymphocytes naïfs (T et B) entrent dans le ganglion lymphatique par des veinules endothéliales hautes (HEV) ou des vaisseaux lymphatiques afférents, et sortent par les sinus corticaux, les sinus médullaires et le vaisseau lymphatique efférent dans la medulla. Parmi les partenaires potentiels du ‘tonic TCR signaling’ des CD4 TN, les cellules dendritiques, les cellules B et les Macrophages représentent les candidats les plus évidents. Ces trois types de cellules exprimant le CMH-II et localisés dans des zones où ils peuvent interagir avec les CD4 TN à état basal, seront étudiés.
Nos données récemment publiées suggèrent fortement que la capacité d'une CD4 TN à s'engager dans la lignée des iTregs lors d'une stimulation appropriée est façonnée par sa capacité à interagir avec le Soi dans son environnement d'origine. Nous comparerons d'abord la réponse cellulaire des CD4 TN Ly-6C- et Ly-6C+ aux signaux de polarisation en iTregs. Dans un second temps, les molécules candidates identifiées précédemment seront ciblées dans le but de moduler la génération d’iTregs in vitro et in vivo.

Un article décrivant nos résultats récents est actuellement soumis pour publication

Les étapes de sélection négative et positive au niveau du thymus aboutissent, après élimination des cellules ne présentant aucune affinité pour le Soi (molécule du CMH du Soi complexée à un peptide du Soi) et des cellules les plus autoréactives, à la production de Lymphocytes T (LT) exprimant un TCR d’une affinité minimale mais réelle pour le Soi. Parmi ceux-ci, les LT (CD4+) de plus forte affinité pour le Soi se différencient en cellules régulatrices dites naturelles (nTreg).

En périphérie, le répertoire pré-immun des LT se composent à près de 70% de LT naïfs. Les 30% restants se répartissent entre migrants thymiques récents au phénotype proche, cellules T régulatrices (Foxp3+) et cellules au phénotype activé/mémoire. Les cellules T naïves reçoivent des signaux de survie, apportés par des interactions constantes avec le Soi et des cytokines telles que l’IL7, leur permettant de se maintenir à long terme. Leur phénotype naïf s’accompagne de l’expression de molécules comme CD62L et CCR7, leurs permettant de circuler entre les organes lymphoïdes secondaires.

En absence d’antigènes étrangers, les LT périphériques circulent entre les différents organes lymphoïdes, où ils interagissent de façon fréquente et transitoire avec des cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Ces interactions avec les CPAs induisent un état tonique du TCR (appelé ‘tonic signaling’) ayant pour conséquence une plus grande réactivité des LT pour leur antigène spécifique.

Lors d’une stimulation antigénique, les LT CD4 naïfs (LTN CD4), ont la capacité de s’engager dans diverses voies de différenciation. Ainsi, les CD4 TN, peuvent se différencier en effecteurs TH1, TH2, TH17 ou en cellules T régulatrices induites (iTreg) caractérisés par leur production de cytokines et des fonctions spécifiques. Le contexte immunologique dans lequel les LTN CD4 baignent lors de leur activation est connu pour dicter cette différenciation. Parmi ces effecteurs CD4, les iTregs, dont la génération dépend du TGFß, sont d’un intérêt majeur. En effet, ces cellules présentent des caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles comparables aux nTreg qui jouent un rôle crucial dans le maintien de la tolérance immunitaire périphérique.

Nos travaux récents renforcent le lien entre le ‘tonic signaling’ reçu par les LTN CD4 à l'état basal et leur devenir en phase effectrice. Nous avons démontré que les interactions avec le Soi, non seulement augmentaient quantitativement, mais façonnaient également qualitativement la réponse des LTN CD4 à leur antigène spécifique en phase effectrice. En effet, nous avons démontré que les LTN CD4 avec la plus grande avidité pour le Soi avaient une différenciation biaisée vers la lignée des iTreg.

Ainsi, nos résultats récents suggèrent que des interactions continues / chroniques avec le Soi façonnent à la fois le phénotype et le comportement des LTN CD4 en phase effectrice en favorisant leur différenciation en cellules iTreg. Nous prévoyons maintenant d'étendre cette étude en :
1- identifiant les partenaires cellulaires de ce 'tonic signaling'
2- Décryptant les voies moléculaires initiées par le ‘tonic signaling’.
3- Identifiant les molécules impliquées dans la plus grande sensibilité des LTN CD4 les plus autoréactifs aux signaux de polarisation en iTreg.
4- Identifiant des cibles permettant de moduler le potentiel de différenciation en iTreg des LTN CD4 in vivo dans différentes conditions pathologiques.