DS0408 - Étude des mécanismes de défense de l’organisme

Remodelage du cytosquelette par les endosomes de stockage- mécanismes moléculaires et leur impact sur la réponse immune – CytoEndoStor

CytoEndoStor-Remodelage du cytosquelette par les endosomes de stockage- mécanismes moléculaires et leur impact sur la réponse immune

Les endosomes de stockage à recyclage lent (SRSE) sont une population endosomale particulière décrite par l'aminopeptidase IRAP, une protéine à double fonction.

Objectifs principaux

L'objectif principal du projet CytoEndoStor est de découvrir les mécanismes moléculaires par lequels les SRSE affectent la dynamique du cytosquelette et estimer son impact in vivo sur les cellules T et la fonction DC. À cette fin, nous proposons de : 1. Identifier les interactions moléculaires qui contrôlent le trafic de SRSE; 2. Caractériser les SRSE dans la biologie des cellules T, et leur impact sur l'activation des cellules T endogènes; 3. Étudier la fonction de SRSE dans les interactions et la migration des cellules et des cellules T.

Nous allons atteindre les objectives du projet CytoEndoStor en utilisant des techniques in vitro de biologie cellulaire et d’immunologie et des études in vivo de la réponse immune des animaux déficients pour l’aminopeptidase IRAP.
Les techniques de biologie cellulaire maitrisées par nos équipes sont : l’imagerie cellulaire de haut niveau, le fractionnement cellulaire suivi des analyses biochimiques comme le immunoblot, l’isolation de complexes protéiques et leur identification par la spectrométrie de masse, l’inactivation des protéines en lignées de cellules DC et T par le shRNA lentiviral ou plus récemment par la technologie CRISP9/Cas9. Ces expériences de biologie cellulaire sont complémentées par des études de présentation antigénique in vitro, d’activation de cellules dendritiques et d’activation de cellules T.
L’impact de mécanismes moléculaires découverts in vitro sur la physiologie de la réponse immune in vivo sera étudie a l’aide des souris inactivées pour l’aminopeptidase IRAP (constitutivement et conditionnels knock-out).

Objectif 1: Interactions moléculaires qui contrôlent le trafic de SRSE.
La suppression d’IRAP dans les cellules dendritiques accélère la maturation des endosomes et augmente l'activation des TLR endosomaux. Nous avons émis l'hypothèse que les interactions IRAP avec les membres de la famille de formines FHOD ou avec la vimentine sont importantes pour l'ancrage des SRSE au cytosquelette d'actine. Pour tester cette hypothèse, nous avons inactivé la Formins FHOD et la vimentine dans les cellules dendritiques. La déplétion de la vimentine n'a pas affecté le trafic SRSE et l'activation des TLR endosomaux. Nous avons constaté que les DC dérivés de monocytes (équivalent de DC dérivés de la moelle osseuse), expriment principalement la formin FHOD4. Similaire à la délétion de l'IRAP, la déplétion de la formine FHOD4 dans ces cellules par shRNA lentiviral a déstabilisé le compartiment des SRSE, a accéléré le trafic de TLR9 et de ses ligands vers les lysosomes et a fortement augmenté la réponse inflammatoire à TLR9. Nous avons récemment publié ces résultats dans Nat. Immunology 2017.
Objectif 2. Caractériser les SRSE dans la biologie cellulaire des cellules T et leur impact sur l’activation des cellules T endogènes
Nos données préliminaires ont suggéré un rôle intrinsèque aux cellules T pour IRAP dans l'activation des lymphocytes T. Les co-immunoprécipitations et l'identification par spectrométrie de masse des partenaires d'interaction de la protéine IRAP ont montré que IRAP interagit avec le TCR (T Cell Receptor). Des expériences de microscopie confocale ont démontré que le TCR est une cargaison d'endosomes IRAP + / Rab4 +. En l'absence d’IRAP, le recyclage du TCR est compromis et la signalisation via le TCR est diminuée, comme en témoignent le déficit de phosphorylation de CD3, Lck, PLC et ZAP.

Dans le cadre de notre deuxième objectif, nous testerons l'hypothèse que les endosomes IRAP / Rab4 + sont nécessaires pour une signalisation optimale via le TCR en utilisant une molécule rapportrice CD3 dans laquelle CD3 est fusionné à la GFP et ZAP70 à mCherry. Cette construction permet d'identifier les vésicules intracellulaires pour la signalisation du TCR et de quantifier par FRET l'intensité de la signalisation du TCR. De plus, nous étudierons in vivo l'importance d’IRAP dans les cellules T par l’immunisation de souris qui sont déficitaires pour IRAP exclusivement dans les cellules T. Nous avons croisé des souris IRAP-lox-lox (S. Chai - Monash University) et nous les avons croisé avec des souris Lck-Cre (S Lotersztajn, U1149, Bichat). La souche de la souris portant une deletion du gene IRAP spécifique aux cellules T a été établie recemment dans notre laboratoire. Un deuxième modèle pour l'étude de la fonction IRAP dans les lymphocytes T in vivo a été obtenu (souris OT1-Rag2ko-IRAPko) et sera analysé par l'équipe du deuxieme partenaire de notre projet.
Dans le cadre du troisième objectif de notre projet, nous étudierons la fonction de SRSE dans les interactions et la migration des cellules et des cellules T. Le troisieme partenaire de notre projet a déjà mis en place les méthodes expérimentales pour analyser les DC et la migration de lymphocytes T deficientes pour IRAP dans des gels du collagène. Le rôle des partenaires d'interaction protéiques d’IRAP (tels que les FHOD) sera étudié dans les cellules (DC-like DC2.4 et Jurkat T cells) dans lesquelles FHOD sera supprimé par la méthode CrispR / Cas9, qui a été récemment mise en place dans nos équipes.

1. Babdor J, Descamps D, Adiko AC, Tohmé M, Maschalidi S, Evnouchidou I, Vasconcellos LR, De Luca M, Mauvais FX, Garfa-Traore M, Brinkmann MM, Chignard M, Manoury B, Saveanu L. IRAP(+) endosomes restrict TLR9 activation and signaling. Nat Immunol. 2017 May;18(5):509-518
2. Nadia Elkhatib, Enzo Bresteau, Francesco Baschieri, Alba L?pez Rioja, Guillaume van Niel, Stéphane Vassilopoulos and Guillaume Montagnac. Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration. Science. In press
3. Trinquand A, Dos Santos NR, Tran Quang C, Rocchetti F, Zaniboni B, Belhocine M, da Costa de Jesus C, Lhermitte L, Tesio M, Dussiot M, Cosset FL, Verhoeyen E, Pflumio F, Ifrah N, Dombret H, Spicuglia S, Chatenoud L, Gross DA, Hermine O, Macintyre E, Ghysdael J, Asnafi V. Triggering the TCR developmental checkpoint activates a therapeutically targetable tumor suppressive pathway in T-cell leukemia. Cancer Discov. 2016 Sep;6(9):972-85.
4. Goudin N, Chappert P, Mégret J, Gross DA, Rocha B and Azogui O. Depletion of regulatory T cells induces high numbers of dendritic cells and unmasks a subset of anti-tumor CD8+CD11c+ PD-1lo effector T cells. PLoS One. 2016 Jun 24;11(6):e0157822.

L’activation des cellules T naïves par les cellules dendritiques (DCs) est un processus particulièrement dynamique, dans lequel le cytosquelette cellulaire de chaque cellule subit des réarrangements coordonnés cruciaux au déroulement d’une réponse immune normale. Les mécanismes moléculaires permettant ces réarrangements coordonnés sont encore mal compris. Nous proposons, basé sur nos données préliminaires, qu'une nouvelle classe de vésicules intracellulaires, les SRSE (Slow Recycling Storage Endosomes), soit impliquée dans le remodelage du cytosquelette nécessaire au fonctionnement optimal des cellules dendritiques et lymphocytes T.
Un marqueur très spécifique des SRSE est l'aminopeptidase IRAP (Insulin Regulated AminoPeptidase), une protéine qui a deux fonctions distinctes. La première est une activité enzymatique requise pour le découpage des antigènes lors la présentation croisée via les CMH I (Saveanu et al. Science 2009). La seconde, que nous avons récemment découverte, est indépendante de cette activité aminopeptidase et permet la régulation du trafic endosomal en modulant la formation et la stabilité des SRSE. En fonction des types cellulaires, la déstabilisation des SRSE affecte la physiologie des cellules de différentes façons. Dans les DCs, cela modifie la présentation croisée des antigènes, la maturation des phagosomes et la signalisation des TLR endosomaux (manuscrit en préparation), tandis que dans les lymphocytes T CD8+, cela module in vivo leur activation et amplification (résultats préliminaires). Les phénotypes observés pourraient être le résultat d'une interaction complexe entre dynamique du cytosquelette et SRSE. En effet, si les composants du cytosquelette sont essentiels pour la localisation et le mouvement des vésicules intracellulaires, nous avons récemment montré qu’inversement, les vésicules d'endocytose contrôlent certains aspects de la dynamique du cytosquelette (Montagnac et al., Nature, 2013). L’ensemble de ces données permet donc de proposer que les SRSE seraient capable d'induire des modifications locales du cytosquelette.
L'objectif principal de ce projet est de découvrir le mécanisme moléculaire par lequel les SRSE affectent la dynamique du cytosquelette et d'en estimer l’impact in vivo sur les fonctions des DC et des lymphocytes T. À cette fin, nous proposons de: 1) Identifier les interactions moléculaires qui contrôlent le trafic des SRSE, 2) caractériser les SRSE dans le contexte de la biologie cellulaire des cellules T, et leur impact sur leur activation et fonction et 3) étudier la fonction des SRSE dans les interactions entre les DCs et les cellules T, et leurs propriétés de migration.
Les résultats obtenus au cours de ce projet devraient apporter de nouvelles connaissances fondamentales sur les mécanismes cellulaires impliqués dans la fonction et les voies de régulation des cellules T et dendritiques.

Coordinateur du projet

Madame Loredana Saveanu (U1149 Centre de Recherche sur l'inflamamtion)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

INSERM Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
INSERM U1170 Institut National de la Santé et de la Recherche médicale U1170, Institut Gustave Roussy
INSERM U1149 Centre de Recherche sur l'inflamamtion

Aide de l'ANR 609 415 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2015 - 48 Mois

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