DS0408 - Étude des mécanismes de défense de l’organisme

Inflammation et lésions endothéliales induites par le Complément et l’hémolyse – INFLACOMP

Mécanismes d'inflammation induite par le complément et endommagement des cellules endothéliales dans les conditions hémolytiques

Le Complément est un système de surveillance entrainant une inflammation et des lésions tissulaires s’il est activé de façon excessive. L’hème libéré par l’hémolyse représente un signal danger et provoque une inflammation. L’activation du Complément et l’hémolyse coexistent fréquemment en pathologie (syndrome hémolytique et urémique (SHU), malaria, drépanocytose etc…) mais leurs relations peu connues. Nous avons démontré que l’hème active la voie alterne du complément,

Objectif: mieux comprendre les mécanismes par lesquels le complément produit des lésions endothéliales dans les conditions de stress de l’hémolyse.

Notre tâche 1 sera d’apporter des informations sur les mécanismes d’action de l’inflammation induite par le complément. Nous étudierons les façons dont le complément induit l’activation des cellules endothéliale. Notre tâche 2 consistera à améliorer notre compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’activation du complément par l’hème sur les cellules endothéliales. Nous identifierons les récepteurs des cellules endothéliales qui détectent la présence de l’hème, les voies de signalisation déclenchées par les différents produits dérivés de l’hémolyse et leurs conséquences sur la modulation de l’expression de différents marqueurs cellulaires. Nous caractériserons leur contribution à la susceptibilité des cellules endothéliales aux effets du complément. Cela nous permettra d’identifier des molécules contrôlant ces mécanismes et ayant des potentiels thérapeutiques.Si beaucoup de maladies hémolytiques sont associées à des complications rénales, la raison exacte de cette association n’est pas claire et le rôle de l’inflammation déclenchée par le complément n’a pas été étudié dans ce contexte. Notre objectif est de répondre à la question de la susceptibilité particulière du rein à l’inflammation induite par l’hémolyse et de la contribution éventuelle du complément à ce phénomène. Nos données préliminaires suggèrent qu’un élément clé est l’incapacité des cellules endothéliales glomérulaires à surexprimer HO-1 en présence de l’hème. Notre troisième tâche sera de déchiffrer les interactions entre l’environnement hémolytique et le niveau du gène et de la protéine de HO-1 dans l’endothélium glomérulaire. Il s’agira aussi de voir si HO-1 contribue à la susceptibilité de l’endothélium glomérulaire aux lésions induites par l’hème et le complément. Nous rechercherons si le polymorphisme du promoteur du gène de HO-1, ayant pour effet une expression plus faible de la protéine, est un gène de susceptibilité pour le développement du SHUa.

Le projet est composé de 3 parties interdépendantes :
Partie 1. Etude du rôle de l’hème et des produits dérivés de l’hémolyse sur la stimulation des cellules endothéliales et leucocytaires et sur leur capacité à activer le complément.
Les méthodes utilisées seront la purification et culture cellulaire (dans des conditions statiques ou sous l’effet de flux ), la cytométrie en flux, la microscopie de fluorescence, la mesure de l’interaction cellulaire en temps réel ainsi que la videomicroscopie. La partie in vivo fera appel à des techniques d’ELISA, d’histologie rénale et d’immunohistochimie afin de mesurer l’activation du complément dans le sang ou directement in situ.
Partie 2. Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’activation du complément sur les cellules endothéliales par l’hème.
Cette étude sera réalisée en utilisant des méthodes de culture cellulaire, cytométrie en flux, microscopie de fluorescence, western blot, expression de protéines recombinantes, résonnance plasmonique de surface. Des modèles murins seront également utilisés (mesure de la fonction rénale, activation du complément, histologie, immunohistochimie, expression des gènes)
Partie 3. Etude de l’hème oxygénase 1 (HO-1) en tant que potentiel facteur de susceptibilité dans le développement de maladies hémolytique dépendantes du complément.
L’objectif principal est de comprendre le rôle de HO-1 en tant que élément de défense cellulaire limitant l’activation du complément et les dommages cellulaires causés par l’hème. Cette étude sera réalisée en utilisant des méthodes de culture cellulaire, cytométrie en flux, microscopie de fluorescence, western blot. Des modèles murins d’injection du l’hème ou induction d’hémolyse seront également utilisés.

1. Découverte des mécanismes de l’activation du complément dans des conditions hémolytiques in vivo. L’hème libre ou associés aux microvésicules érythrocytaires peut activer le complément contrairement à l’hémoglobine. Cette activation est à l’origine de forts dépôts de C3 au niveau rénal et notamment sur l’endothélium glomérulaire. Ces résultats sont particulièrement relevants dans la drépanocytose où les microvésicules érythrocytaires activent fortement le complément en comparaison à celles de sujets sains. L’hémopexine, un scavenger de l’hème, est actuellement en développement en tant qu’agent thérapeutique potentiel dans la drépanocytose et à la capacité de prévenir complétement l’activation du complément par l’hème.

2. Les mécanismes moléculaires et cellulaires responsables des dépôts de complément sur l’endothélium sont liés à la stimulation du TLR4. Cette voie de signalisation, différente de celle induite par le LPS, résulte à la translocation de NFkB au niveau nucléaire conduisant à l’expression de gènes et à la mobilisation rapide de granules des cellules endothéliales contenant de la P-selectine et du facteur von Willebrand. La P-sélectine peut se liée au C3b et C3(H2O) pour initier l’activation du complément. Ces processus ont été montrés in vitro et l’importance du TLR4 pour le dépôt de C3 vasculaire in vivo.

3. Mise en évidence de l’incapacité des cellules endothéliales glomérulaires à s’adapter à l’hémolyse en raison d’une expression de HO-1 inefficace. Cette incapacité promeut les dépôts de C3 en conditions hémolytiques. Ces changements phénotypiques en conditions hémolytiques affectent la régulation du C3 et les processus de dégradation de l’hème ce qui pourrait expliquer le tropisme rénal des lésions de l’endothélium dans le SHUa.

Les perspectives de ce projet :
- Preuve de principe que l’hémolyse est un acteur clé dans l’établissement de la microangiopathie thrombotique in vivo, dans un modèle susceptible à développer le SHUa.
- Identification des nouvelles thérapies potentielles pour contrôler l’activation du complément dans des conditions hémolytiques et plus particulièrement dans le contexte du SHUa.
- Evaluer in vivo le rôle du TLR4 dans l’activation du complément dans des conditions hémolytiques

Dans ce projet, nous utiliserons le SHUa comme modèle mais nos résultats pourront facilement être étendus à d’autres maladie hémolytiques comme la drépanocytose, la ?-thalassémie, l’hémoglobinurie paroxystique nocturne et même le choc septique et la malaria. Ces résultats apporteront de nouvelles bases de nouvelles démarches thérapeutiques efficaces pour contrôler l’activation du complément dans les maladies hémolytiques.

1. Pedersen DV, Roumenina L, Jensen RK, Gadeberg TA, Marinozzi C, Picard C, Rybkine T, Thiel S, Sørensen UB, Stover C, Fremeaux-Bacchi V, Andersen GR., Functional and structural insight into properdin control of complement alternative pathway amplification., EMBO J. 2017 Apr 13;36(8):1084-1099.
2. Roumenina LT, Rayes J, Frimat M, Fremeaux-Bacch, Endothelial cells: source, barrier, and target of defensive mediators., Immunol Rev. 2016 Nov;274(1):307-329.
3. Roumenina LT, Rayes J, Lacroix-Desmazes S, Dimitrov JD. Heme: Modulator of Plasma Systems in Hemolytic Diseases., Trends Mol Med. 2016 Mar;22(3):200-13.

Le Complément est un système de surveillance entrainant une inflammation et des lésions tissulaires s’il est activé de façon excessive. L’hème, groupement prosthétique contenant le Fer de l’hémoglobine, est un transporteur d’oxygène des érythrocytes. L’hème libéré par l’hémolyse représente un signal danger et provoque une inflammation et un dysfonctionnement des cellules endothéliales, en produisant des ROS et une signalisation via le récepteur TLR4. L’activation du Complément et l’hémolyse coexistent fréquemment en pathologie (syndrome hémolytique et urémique (SHU), malaria, drépanocytose etc…) mais leurs relations peu connues. Nous avons démontré récemment que l’hème active la voie alterne du complément, déclenchant un cercle vicieux de lésions rénales dans une maladie hémolytique faisant intervenir le complément, le syndrome hémolytique et urémique atypique (SHUa). Mais on connaît mal les liens entre une exposition de l’endothélium aux produits dérivés de l’hémolyse et l’activation du complément qui en découle.
Notre objectif est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels le complément produit des lésions endothéliales dans les conditions de stress de l’hémolyse. Nous étudierons aussi les mécanismes de défense des cellules endothéliales vis à vis du stress causé par l’hème. Notre première tâche sera d’apporter des informations sur les mécanismes d’action de l’inflammation induite par le complément. Nous étudierons les façons dont le complément induit l’activation des cellules endothéliales et des leucocytes inflammatoires et leurs interactions dans les conditions de stress dérivant de l’hémolyse. Notre deuxième tâche consistera à améliorer notre compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de l’activation du complément par l’hème sur les cellules endothéliales. Nous identifierons les récepteurs des cellules endothéliales qui détectent la présence de l’hème, les voies de signalisation déclenchées par les différents produits dérivés de l’hémolyse et leurs conséquences sur la modulation de l’expression de différents marqueurs cellulaires. Nous caractériserons leur contribution à la susceptibilité des cellules endothéliales aux effets du complément. Cela nous permettra d’identifier des molécules contrôlant ces mécanismes et ayant des potentiels thérapeutiques. Cette deuxième tâche comprendra aussi la recherche des mécanismes moléculaires liant la stimulation des cellules endothéliales par l’hème et l’activation du complément. Si beaucoup de maladies hémolytiques sont associées à des complications rénales, la raison exacte de cette association n’est pas claire et le rôle de l’inflammation déclenchée par le complément n’a pas été étudié dans ce contexte. Notre objectif est de répondre à la question de la susceptibilité particulière du rein à l’inflammation induite par l’hémolyse et de la contribution éventuelle du complément à ce phénomène. Nos données préliminaires suggèrent qu’un élément clé est l’incapacité des cellules endothéliales glomérulaires à surexprimer HO-1 en présence de l’hème. Notre troisième tâche sera de déchiffrer les interactions entre l’environnement hémolytique et le niveau du gène et de la protéine de HO-1 dans l’endothélium glomérulaire. Il s’agira aussi de voir si HO-1 contribue à la susceptibilité de l’endothélium glomérulaire aux lésions induites par l’hème et le complément. Nous rechercherons si le polymorphisme du promoteur du gène de HO-1, ayant pour effet une expression plus faible de la protéine, est un gène de susceptibilité pour le développement du SHUa.
Dans ce projet, nous utiliserons le SHUa comme modèle mais nos résultats pourront facilement être étendus à d’autres maladie hémolytiques comme la drépanocytose, la b-thalassémie, l’hémoglobinurie paroxystique nocturne et même le choc septique et la malaria. Ces résultats apporteront de nouvelles bases de nouvelles démarches thérapeutiques efficaces pour contrôler l’activation du complément dans les maladies hémolytiques.

Coordinateur du projet

Madame Lubka Roumenina (INSERM UMRS 1138 Cordeliers Research Center)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UMRS 1138 INSERM UMRS 1138 Cordeliers Research Center

Aide de l'ANR 218 400 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2015 - 36 Mois

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