DS0402 - Décryptage des fonctions biologiques élémentaires et de leur intégration

Identification de nouvelles protéines qui contrôlent la persistance de migration – NovProtMig

NovProtMig

Une nouvelle machine moléculaire qui régule la persistance de la migration cellulaire

La persistance de migration est le paramètre qui indique combien de temps une cellule persiste dans une direction une fois qu’elle l’a prise.

Pour migrer efficacement, les cellules doivent être persistantes. Quand les cellules migrent de manière aléatoire, il y a déjà une certaine persistance. Quand les cellules migrent de manière dirigée, la persistance est biaisée dans la direction de l’attraction ou de la répulsion. On ne sait pas grand-chose sur la régulation de la persistance, si ce n’est qu’une voie de signalisation est centrale, la voie Rac1-WAVE-Arp2/3, et que cette voie est au cœur de retro-régulations qui contrôlent la durée de signalisation. La migration cellulaire permet aux organes de maintenir leur architecture et leur fonctionnalité. Elle permet aussi malheureusement aux cellules tumorales de se disséminer dans l’organisme. Pour ces deux raisons, il est critique d’avancer sur la compréhension de la persistance de migration.

Nous avons ainsi identifié deux nouvelles protéines qui s’associent de manière différente au complexe WAVE suivant que la voie est activée ou non ou bien alors qu’elle est activée mais que les rétrocontrôles sont abrogés en inhibant les fibres formant le squelette de la cellule. De manière surprenante, ces nouvelles protéines s’associent avec les protéines formant la coque du complexe régulateur de WAVE, mais sans WAVE, indiquant que ces protéines prennent la place du WAVE au sein de ce nouveau complexe, que nous avons appelé “complexe coque de WAVE”.

Nous avons purifié le complexe coque de WAVE afin de déterminer sa composition et sa structure, grâce à une observation directe en microscopie électronique, qui permettra dans le meilleur des cas d’obtenir une résolution atome par atome de cette nouvelle machine moléculaire. Nous avons d’ores-et-déjà révélé le rôle du complexe coque de WAVE dans la persistance de migration. Nous cherchons à comprendre le rôle du complexe coque de WAVE dans les migrations dirigées. En effet, la migration aléatoire des cellules peut être biaisée par la rigidité et la composition du substrat. Les cellules migrent vers les zones les plus dures et les denses en fibres de matrice, telles que le collagène. Une de ces deux nouvelles protéines est mutée dans les cancers, en particulier de l’utérus, des ovaires et du sein. Les formes mutées ne sont plus capables de s’associer au complexe coque de WAVE et de réguler la migration cellulaire, ce qui confirme l’importance de la persistance de migration dans la progression cancéreuse.

Nos études permettent donc d’espérer trouver des moyens d’interférer avec la formation des métastases pour le plus grand bénéfice des patientes atteintes de ces cancers.

Wang Y, Boutillon A, Fokin AI, Chiapetta G, Vinh J, David NB, Gautreau AM*, Polesskaya A*. 2021. The WAVE shell complex, a novel molecular machine controlling migration persistence. In preparation.

Cette étude qui implique les 3 partenaires de notre consortium deviendra très vraisemblablement une publication majeure du champ d’étude. Cette étude est l’application la plus directe de notre financement ANR NovProtMig.

La plupart des cellules normales migrent sur leur substrat grâce à des protrusions riches en actine. La migration doit être à la fois efficace et pouvoir répondre rapidement à des signaux qui la guident. Ici nous nous attaquons au défi de comprendre comment les protrusions peuvent être maintenues dans le temps, ou au contraire rétractées rapidement pour arrêter la migration et permettre à la cellule de tourner. Les modélisateurs ont identifié les "feedbacks" positifs et négatifs comme étant responsables de ces régulations versatiles. Malgré leur importance, ces circuits de signalisation sont rarement disséqués à l'échelle moléculaire. Notre projet a donc pour but d'identifier de nouveaux composants des feedbacks, de caractériser leur rôle dans la migration cellulaire, in vitro et in vivo, et de disséquer les mécanismes par lesquels ils contrôlent la persistance cellulaire.

Les feedbacks liés à l'actine impliquent que l'actine soit détectée et qu'elle agisse sur les régulateurs de la polymérisation d'actine. Nous identifierons des senseurs de feedback grâce à leur proximité avec le complexe Arp2/3 qui crée la jonction branchée des filaments d'actine. Pour cela, nous emploierons la biotinylation de proximité combinée à de la protéomique différentielle pour identifier les protéines avoisinant Arp2/3 dans les cellules sauvages qui génèrent des protrusions, mais pas dans les cellules knock-out pour Rac qui ne peuvent pas en générer. Nous identifierons des effecteurs de feedback grâce à leur association différentielle au complexe WAVE qui active Arp2/3 ou à Arpin qui inhibe Arp2/3, quand la polymérisation d'actine est bloquée ou non. Comme alternative à ces cribles protéomiques, nous avons déjà identifié 9 nouveaux effecteurs de Rac grâce à de multiples cribles double-hybride dans des banques de cDNA différentes.

Les candidats obtenus seront alors testés pour leur importance fonctionnelle dans la migration cellulaire. Ces tests seront réalisés in vitro pour un crible quantitatif rapide et in vivo pour s'assurer de leur importance physiologique. La gastrula de zebrafish permettra des approches de génétique fonctionnelle directes et une excellente imagerie 3D. Nos modèles in vitro et in vivo couvrent des migrations de cellules individuelles et collectives, des marches aléatoires comme des migrations dirigées. Nous avons développé des programmes informatiques qui mesurent l'efficacité de migration et la persistance cellulaire, grâce à des fonctions d'autocorrélation de la vitesse et de la persistance directionnelle. L'inactivation de nos candidats par ARNi, morpholinos, et dans un deuxième temps, CRISPR-Cas9, nous permettra de sélectionner les deux protéines affectant le plus fortement ces paramètres in vitro et in vivo.

L'effet des deux protéines sélectionnées sur la dynamique de la protrusion membranaire et du cytosquelette d'actine sera analysé sur des films à haute fréquence d'acquisition. La localisation dynamique de nos protéines sélectionnées sera analysée grâce à des protéines de fusion GFP. Puis nous rechercherons des corrélations croisées entre ces différents paramètres dynamiques pour voir par exemple si nos protéines participent à la protrusion ou au contraire apparaissent juste avant la rétraction. Finalement, nous examinerons la contribution spécifique de ces protéines aux feedbacks de migration. Pour cela, nous analyserons grâce à un biosenseur comment Rac est activé en réponse à une dose localisée et transitoire de Rac activé, délivrée par optogénétique. Deuxièmement, nous mesurerons l'hystérésis de la migration cellulaire, c'est-à-dire le temps pendant lequel la migration directionnelle persiste quand on éteint un stimulus biophysique qui guide la migration. Ces mesures directes du feedback, dans des contextes sauvages et perte-de-fonction, placeront sans ambiguïté les nouveaux régulateurs identifiés dans des feedbacks positifs ou négatifs.

Coordinateur du projet

Monsieur ALEXIS GAUTREAU (Ecole Polytechnique)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IBENS Institut de Biologie de l'Ecole Normale Supérieure
BIOC Ecole Polytechnique
IBENS Institut de Biologie de l'Ecole Normale Supérieure
CNRS USR 3149, ESPCI ParisTech Unité de Spectrométrie de Masse Biologique et Protéomique (SMBP)

Aide de l'ANR 450 000 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2015 - 36 Mois

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