Les interactions biomoleculaires révélées par la fluorescence PICOseconde dans des PICOlitres – PICO2

Un premier volet (tâche 2) consiste à appliquer un nouveau concept expérimental combinant FRT et microfluidique de gouttes (DmF) pour l’étude d’interactions au sein de systèmes biomoléculaires hors-équilibre. La FRT, dans des mesures d’ensemble, révèle des distributions de durées de vie de fluorescence représentatives de l’hétérogénéité structurale des biomolécules. Simultanément, la DmF sert à produire des complexes biomoléculaires hors-équilibre (mélange rapide). Cette approche expérimentale innovante sevira à l'étude due mécanisme de l’activité chaperonne (i.e. promotion de changements structuraux fonctionnels d’ADN) de la protéine NCp7 du VIH (expertise du Partenaire 3, LBP, Illkirch), étudiée ici comme système modèle pour les interactions dynamiques entre acides nucléiques et protéines.

Un second volet, technologique (Tâche 3), consiste à développer la mesure de FRT par comptage de photons uniques corrélés en temps (TCSPC) pour le criblage à haut débit (HD) d’interactions biomoléculaires. A la différence de la mesure de fluorescence en intensité, abondamment utilisée dans les biotechnologies HD, la FRT est une mesure intrinsèque, donc plus fiable, de l’interaction de biomolécules fluorescentes. Les L’objectif est donc de développer la technologie (microélectronique CMOS) pour la détection et l’analyse en temps réel des signaux de TCSPC, permettant la mise en œuvre effective de cytométrie en flux et criblage à HD, selon un brevet déjà déposé par les Partenaires 1 et 2. Un prototype sera produit et validé par une démonstration de criblage de quelques inhibiteurs connus de la protéine NCp7.
Un dernier volet (Tâche 4) purement technologique permettra de décupler la cadence d’acquisition et de traitement des signaux de TCSPC. Cela permettra d’augmenter d’autant la cadence de mesure de FRT par TCSPC, ou de concevoir un détecteur linéaire multicanal, constitué d’une ligne de pixels, c’est-à-dire une caméra à balayage de fente intégrée en technologie CMOS.

• Combinaison TRF/Microfluidique pour l’étude de dynamique structurale :
o Approche expérimentale TRF+droplet microfluidique développée et appliquée à des experiences de « saut de pH » pour l’étude de la relation structure ?photophysique de protéines fluorescentes (IPCMS, Coll. H. Pasquier initiée avant début ANR) => un article en cours de rédaction
o Hybridation (+)/(-) PBS : expériences préliminaires en cours dans gouttes microfluidiques (IPCMS)
• Etude/application nouvelles sondes fluorescentes de structure :
o Etude photophysique d’un dérivé d’hydroxychromone (absorption transitoire femtoseconde) article en préparation (IPCMS/LBP)
o Caractérisation de la cinétique (+) / (-) PBS, à l'aide de la sonde 3HCnt
o Perturbation de la structure d'un duplex par l'introduction de la sonde 3HCnt
• Application TRF aux biotechnologies :
o démonstration de bonnes performances pour un test d’activité enzymatique par TRF dans des microgouttelettes à haut débit (IPCMS, ICUBE, coll Novartis) : article publié.
o projet prématuration CNRS (2016-17) : conception d’un prototype pour contact avec partenaires industriels (IPCMS, ICUBE, Coll. A. Griffiths)
o Implémentation routine de fit rapide en FPGA (real-time analysis) => proceeding de conference (IPCMS,ICUBE, coll. D. Fey)
• Développement microélectronique :
o Générateur d’impulsion laser picoseconde à haut taux de répétition à base de diode laser finalisé. Puissance moyenne de l’ordre de 1mW à 80MHz, largeur d’impulsion de l’ordre de 100 ps FWHM (ICube).
o Capteur CMOS monovoie développé et retournée de fonderie. Convertisseur temps vers numérique déjà testé et offrant une résolution temporelle de 10 ps. Test du système de détection optique en cours (ICube).

o Developpement de nouvelles sondes de fluorescence pour la comprehension interaction porteine/ADN
o Recherche partenariats industriels pour l'application de TCSPS en haut débit

Revues à comité de lecture:
“Towards Sensitive, High-Throughput, Biomolecular Assays Based on Fluorescence Lifetime”, Anastasia Ioanna Skilits et al., Methods and Applications of Fluorescence (submitted) 2017
M. SHOLOKH, et al. «Annealing mechanism of HIV-1 (-)/(+)PBS DNA sequences and its chaperoning by the nucleocapsid protein as revealed by site-selective fluorescence labeling.« Submitted.
L. ZARGARIAN, et al. «Structural and dynamical impact of a universal fluorescent nucleoside analogue based on 3-hydroxychromone inserted into a DNA duplex.« Submitted.

Ouvrages ou chapitres d’ouvrage 1. Dadouche F, Turko T, Malass I, Skilitsi AI, Léonard J, Uhring W. Design, implementation and characterization of Time to Digital Converter on low cost FPGA. In: Yurish S, editor. Advances in Sensors: Reviews, Vol4 “Sensors and Applications in Measuring and Automation Control Systems.” IFSA Publishing, S.L.; 2016.

Prix d'Instrumentation (SCF/SFP) 2016. «Fluorescence résolue en temps pour les biotechnologies à haut débit », Jérémie Léonard,

Les interactions biomoléculaires se caractérisent par une grande hétérogénéité structurale (coexistence de plusieurs conformères) et dynamique structurale (de la picoseconde à plusieurs minutes). La compréhension détaillée des mécanismes moléculaires sous-jacents est d’un intérêt essentiel pour la conception de nouvelles thérapies ciblant spécifiquement ces interactions. Dans ce projet, nous combinons l’expertise de 3 partenaires dans une approche pluridisciplinaire pour développer l’utilisation de la fluorescence résolue en temps (FRT) de biomolécules marquées par des sondes fluorescentes sensibles à leur environnement local, pour étudier/détecter les interactions biomoléculaires.
Un premier volet fondamental (tâche 2) consiste à appliquer un nouveau concept expérimental combinant FRT et microfluidique de gouttes (DmF) pour l’étude d’interactions au sein de systèmes biomoléculaires hors-équilibre. La FRT, dans des mesures d’ensemble, révèle des distributions de durées de vie de fluorescence représentatives de l’hétérogénéité structurale des biomolécules. Simultanément, la DmF sert à produire des complexes biomoléculaires hors-équilibre (mélange rapide). Dans un travail préliminaire, le Partenaire 1 (IPCMS, Strasbourg) a suivi la cinétique de relaxation conformationelle de systèmes moléculaires structurellement hétérogènes sur des centaines de ms, le long du parcours de gouttes dans un canal microfluidique, à l’aide d’une caméra à balayage de fente (CBF) conventionnelle. L’objectif est d’appliquer cette approche expérimentale innovante pour étudier le mécanisme de l’activité chaperonne (i.e. promotion de changements structuraux fonctionnels d’ADN) de la protéine NCp7 du VIH (expertise du Partenaire 3, LBP, Illkirch), étudiée ici comme système modèle pour les interactions dynamiques entre acides nucléiques et protéines. L’étude portera en particulier sur l’activation par NCp7 de 2 réactions d’hybridation de brins complémentaires d’ADN et/ou ARN, essentielles au cycle de réplication du virus.
Un second volet, technologique (Tâche 3), consiste à développer la mesure de FRT par comptage de photons uniques corrélés en temps (TCSPC) pour le criblage à haut débit (HD) d’interactions biomoléculaires. A la différence de la mesure de fluorescence en intensité, abondamment utilisée dans les biotechnologies HD, la FRT est une mesure intrinsèque, donc plus fiable, de l’interaction de biomolécules fluorescentes. Les Partenaires 1 et 2 (ICube, Strasbourg) ont fait la démonstration de principe que le comptage de photons uniques peut être implémenté afin de mesurer la durée de vie de fluorescence de microgouttelettes dans des conditions HD avec une précision suffisante pour une détection binaire (« positif » vs « négatif ») fiable d’interactions biomoléculaires. L’objectif est donc de développer la technologie (microélectronique CMOS) pour la détection et l’analyse en temps réel des signaux de TCSPC, permettant la mise en œuvre effective de cytométrie en flux et criblage à HD, selon un brevet déjà déposé par les Partenaires 1 et 2. Un prototype sera produit et validé par une démonstration de criblage de quelques inhibiteurs connus de la protéine NCp7.
Un dernier volet (Tâche 4) purement technologique permettra de décupler la cadence d’acquisition et de traitement des signaux de TCSPC. Cela permettra d’augmenter d’autant la cadence de mesure de FRT par TCSPC, ou de concevoir un détecteur linéaire multicanal, constitué d’une ligne de pixels, c’est-à-dire une caméra à balayage de fente intégrée en technologie CMOS.
Au cours de ce projet, des applications innovantes de la FRT pour l’étude des interactions biomoléculaires vont améliorer 1) la connaissance fondamentale des mécanismes moléculaires sous-jacents et 2) la technologie disponible pour l’application de la FRT aux biotechnologies. L’émergence de nouvelles directions de recherche et la valorisation des technologies sont parmi les objectifs du projet.