DS0401 - Etude des systèmes biologiques, de leur dynamique, des interactions et inter-conversions au niveau moléculaire

Caractérisation biochimique et structural des complexes protéiques MnmE/MnmG et GTPBP3/MTO1 impliqués dans la modification redox d’ARNts chez les bactéries et chez l’Homme. – MiGRATe

Caractérisation biochimique et struturale des complexe protéiques Mnme/MnmG et GTPBP3 /MTO1 impliqué dans la modification redox d’ARNts chez les bactéries et chez l’Homme

Le but du projet est d’étudier la relation structure/fonction de complexes enzymatiques conservés à travers l'évolution (MnmE/MnmG chez les bactéries et GTPBP3/MTO1 chez l'homme) et impliqués dans la modification 5-carboxyaminométhylation de la position wobble de l'ARNt nécessaire au bon décryptage de l'information génétique. En effet, le défaut de modification entraine des troubles de croissance chez les bactéries et des pathologies sévères chez l'homme.

Comprendre les bases moléculaires du fonctionnement d'un complexe enzymatique de modification des ARNts

Nous avons choisi de focaliser notre projet sur les complexes enzymatiques MnmEG et GTPBP3/MTO1 complexes pour plusieurs raisons:<br />Le mécanisme de réaction catalysé par MnmEG est encore un sujet de discussion. En ce qui concerne GTPBP3 / MTO1, rien n'a été fait au niveau biochimique et structurale.<br />Ces complexes orchestrent une réaction compliquée utilisant le GTP, la glycine (ou la taurine pour le complexe humain), le folate, la flavine, le NADH et l’ARNt. Cette réaction complexe doit être fortement synchronisée et nous supposons que MnmE ou GTPBP3, agissant en tant que commutateur moléculaire, peuvent contrôler la génération d'intermédiaire hautement labile et leur transfert d'une protéine à l'autre. Par conséquent, nous prévoyons de nouveaux mécanismes moléculaires contrôlant le couplage entre la réaction chimique et les changements conformationnelles controlés par l’activité GTPase de MnmE. Nous avons établi un lien physiologique entre l'activité de MnmEG et l'inhibition de MiaB dépendante de FeS, qui est une autre enzyme de modification d'ARNt conservée qui catalyse la formation de ms2i6A37. YgfZ décrit comme une protéine de liaison de folate partage avec MnmE le même domaine de liaison de folate et cette protéine semble protéger le cluster de fer soufre de MiaB de l’activité délétère de MnmE. Par conséquent, l'interaction entre les trois protéines, c'est-à-dire YgfZ, MiaB et MnmEG, ainsi que le rôle du folate dans l'assemblage et la réparation du FeS méritent d'être étudiés plus en détail.<br />Enfin, la compréhension du mécanisme de formation de cmnm5U et du processus de régulation déclenché par MnmEG dans un organisme modèle tel que E. coli et celui de tm5U chez l'humain permet non seulement de mettre en lumière les mécanismes moléculaires des maladies mitochondriales liées au déficit d’activité de GTPBP3/MTO1, mais aussi de favoriser la découverte de futures antibiotiques qui visent spécifiquement MnmEG sans affecter le complexe humain.

Pour caractériser les enzymes et comprendre leurs mode d'action, nous utiliserons des approches biochimiques et enzymologiques traditionnelles en combinaison avec des méthodes structurales telles que la cristallographie aux rayons X et diverses formes de spectroscopie, ainsi que la synthèse organique à petite échelle et les méthodes d’études des cinétiques rapides. En outre, nous allons étudier par des méthodes génétiques, le lien de MnmEG au métabolisme des clusters fer soufre. Nous allons étudier la flavine et le mécanisme de réaction dépendant du folate de MnmEG de E. coli, qui est encore une question de controverse. Notre but principal sera de comprendre: 1- Quelles sont les réactions catalysées par les protéines individuelles MnmE et MnmG? 2-Pourquoi les deux enzymes travaillent-elles en concert pour modifier l'ARNt? Notre connaissance récente d'un système enzymatique homologue nous aidera considérablement à élucider le mécanisme de réaction de la flavine de MnmG. Etant donné que les intermédiaires de la réaction peuvent être très labiles dans les organismes mésophiles, l'utilisation de MnmE / G à partir d'organismes thermophiles pourrait constituer un énorme avantage pour observer et piéger ces intermédiaires. Une tâche importante concernera les aspects structuraux du système enzymatique, notamment la détermination de la structure cristalline du complexe MnmEG. Le but principal sera de découvrir comment MnmE et MnmG travaillent ensemble pour catalyser la modification de l'ARNt et essayer de mettre en lumière les changements conformationnelles qui conduisent à la construction de tunnels importants au transfert d’intermédiaires. Nous avons également l'intention de comprendre l'interaction entre les trois protéines YgfZ, MnmE et MiaB de E. coli ainsi que l'effet de l'acide folique sur l'assemblage des cofacteurs fers soufres. Enfin, l'expression et la purification ainsi que la caractérisation structurale du complexe humain GTPBP3 / MTO1 seront étudiées.

1-Mécanisme de MnmE/MnmG : L’une des hypothèses que nous avions formulé est que MnmEG pourrait avoir un intermédiaire réactionnel commun à celui de l’ARNt méthyltransférase à flavine TrmFO. Cet intermédiaire serait une flavine réduite portant un méthylène sur l’atome N5 du noyau redox de la flavine, et agirait comme l’agent de méthylation des nucléotides. Il a été proposé que ce dernier serait produit transitoirement par l’enzyme grâce à la consommation d’une molécule de NADH pour réduire le FAD et une molécule de methylenetetrahydrofolate (CH2THF) à l’origine du CH2 greffé sur le C5 de l’uridine 34, et qui serait la première étape du mécanisme de modification du tRNA par le complexe enzymatique MnmE/G et par TrmFO. Nous avons pour la première fois réussie à synthétiser cet intermédiaire réactionnel à partir de flavine libre et d’un réactif chimique peu couteux et montré que cet intermédiaire stable peut activer une forme apoprotéine de TrmFO pour méthyler l’ARNt, contournant ainsi la voie de synthèse naturelle. Nous avons aussi montré que cet intermédiaire peut se lier à MnmG et au complexe MnmE/MnmG.
2- Cristallisation du complexe MnmE/MnmG de e. coli : Nous avons pu reconstituer in vivo un complexe MnmE/MnmG stable à l’aide d’une co-expression des deux gènes. Ce complexe a pu être purifié et cristallisé. Nous ne savons pas à ce stade s’il s’agit bien d’un crystal du complexe et pas d’une des protéines du complexe.
3- Etudes des protéines humaines GTPBP3/MTO1 : Nous avons cloné l’isoforme la plus abondante de MTO1 et de GTPBP3 et nous avons essayé de les exprimer. Malheureusement, nous n’avons pas eu d’expression de MTO1. En revanche nous avons réussi à exprimer en grande quantité GTPBP3 pour nos études biochimiques, biophysiques et structurales. Nous avons aussi réussi à obtenir des cristaux de cette protéine du complexe enzymatique humain.

La synthèse d’un intermédiaire stable du cycle catalytique est unique dans le domaine de l’enzymologie. Dans le futur proche nous allons essayer de démontrer si ce dernier, actif dans TrmFO, peut aussi activer le complexe MnmEG et GTPBP3. Un autre point crucial va concerner la poursuite des premiers résultats encourageants concernant les approches de cristallogenèses du complexe MnmEG bactérien. L’étape ultime serait l’obtention de la structure du complexe. Nous nous focaliserons aussi sur la résolution de structure de GTPBP3 humain ainsi que sur l’étude structurale et biochimique des mutations physiopathologiques de cette dernière observées chez les patients souffrants de cardiomyopathies et d’acidose lactique. Un effort important sera consacré à la mise au point de stratégie d’expression de MTO1 humain. Notamment le passage à des systèmes d’expression en levure sera aussi envisagé. Les autres objectifs du projet en autre l’étude de l’effet de MnmEG sur l’assemblage des cofacteurs fer soufre de MiaB seront investigués plus tard.

Un papier sur la synthèse de l’intermédiaire catalytique flavinique doté d’un pouvoir de méthylation des nucléosides et l’activation de l’homologue de MnmG par ce dernier pour la méthylation de l’ARNt a fait l’objet de l’écriture d’un papier qui a été soumis au journal NATURE.

Les modifications post-transcriptionnelles des nucléotides dans l'A.R.N. jouent des rôles intégraux dans le contrôle cellulaire d'informations biologiques codées par l'ADN. Les modifications chimiques d'A.R.N. recouvrent les trois domaines phylogénétiques (Archaea, des Bactéries et Eukaryotes) et sont retrouvées dans tous les types d'A.R.N., y compris l'A.R.N messager, l'A.R.N de transfert (ARNt), l'A.R.N. ribosomique (rRNA), les petits A.R.N. nucléaires (snRNA) et les microA.R.N. (miRNA). Ces modifications ainsi que leur position dans l’ARN sont conservés à travers l’évolution soulignant leur importance physiologique. Parmi les ARNs, les ARNts sont les plus modifiés. Environ 15 %-25 % des nucléosides des ARNt contiennent des modifications. Bien que non entièrement comprises, il a été proposé que ces modifications servent des buts divers : (1) la discrimination des ARNt (par exemple, l'initiateur ARNt-Met est distingué de l'elongateur par ribosylation du A64); (2) la fidélité de la traduction, où l'absence de modification à la position 34 cause des erreurs de lecture parce que la base modifiée limite ou étend la capacité d'interaction codon-anticodon par l'union de base; et (3) la stabilité l’ARNt et le contrôle qualité de la macromolécule. Jusqu'à présent plus de cent types différents de modifications ont été rapportées et plus seront découvertes certainement grâce aux nouvelles technologies de séquençage d'A.R.N. La diversité chimique de ces "nouveau nucléotides" est stupéfiante et déconcertante puisqu'aucune autre macromolécule biologique n'est soumise à une telle énorme transformation biochimique. Des mécanismes spectaculaires ont récemment été découverts et une chimie sans précédent a été observée. En plus de la chimie, la découverte que la catalyse de modifications d'A.R.N. compliquées peut être orchestrée par des édifices complexes avec la participation de plusieurs protéines rend l’étude de l’enzymologie de l’A.R.N. plus attirante et stimulante du point de vue biophysique et structural. C'est le cas de l’hétéro- complexe MnmEG qui catalyse la formation de la 5-carboxymethylaminouridine (cmnm5U ou cmnm5s2U), une modification conservée à travers l’évolution, au niveau de la position 34 de plusieurs ARNt bactériens. Ce type de modification est retrouvée dans les ARNts de la mitochondrie des mammifères par suite de leur origine bactérienne, où le produit final implique l'incorporation de la taurine à la place de la glycine formant 5-taurinomethyluridine. Dans des bactéries, le manque de ces modifications provoque plusieurs phénotypes sévères notamment le retardement de croissance et la perte de virulence tandis que chez l'homme plusieurs syndromes comme le MELAS, le MERRF et d'autres maladies graves sont causées par l'absence de cette modification mitochondriale. De plus, le complexe MnmEG semble avoir un impact négatif sur l’assemblage des cofacteurs Fer/soufre d'une autre importante enzyme de modification. Notre projet à long terme vise à caractériser la relation structure/fonction de deux homologues MnmEG d'E. Coli et son homologue humain, le complexe GTPBP3/MTO1. Pour caractériser les enzymes et interroger leurs modes d'action, nous utiliserons des approches biochimiques et enzymologiques en association avec des méthodes structurales comme la cristallographie des rayons X, diverses techniques de spectroscopie, des méthodes d’études des cinétiques rapides ainsi que de la synthèse organique à petite échelle. De plus nous examinerons in vitro et in vivo notamment par des méthodes génétiques, le nouveau rôle de MnmEG dans l’assemblage des cofacteurs Fer/soufre de plusieurs enzymes.

Coordinateur du projet

Monsieur Djemel Hamdane (Laboratoire de Chimie des Processus Biologiques)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS-UMR8229-collège De France Laboratoire de Chimie des Processus Biologiques

Aide de l'ANR 250 813 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2015 - 42 Mois

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