Caractérisation et importance physiologique de la biosynthèse d'ubiquinone sous différentes tensions d'oxygène – (An)aeroUbi

Afin d’obtenir une compréhension de la biosynthèse aérobie et anaérobie de UQ chez E. coli et l’importance physiologique de UQ dans diverses conditions, nous combinons des approches multi-disciplinaires : la génétique et physiologie des microorganismes, la biologie moléculaire et l’imagerie cellulaire, la biochimie et biologie structurale des protéines ainsi que la synthèse organique de molécules.
Afin de caractériser les protéines UbiJ et UbiK, leur interaction avec d’autres protéines Ubi et leur capacité à lier des lipides, nous utilisons des techniques de biochimie des protéines : surexpression et purification, SEC-MALLS et cristallographie des rayons X, mutagénèse dirigée et fluorescence intrinsèque.
Nous étudions le complexe Ubi multiprotéique par une technique d’électrophorèse native (BN-PAGE) couplée à l’immuno-détection, par microscopie des protéines Ubi fusionnées à des protéines fluorescentes (GFP, m-Cherry) et par purification d’affinité en tandem.
Nous évaluerons le remodelage de la biosynthèse de UQ entre des conditions aérobies et anaérobies par une quantification des transcrits par qRT-PCR, par immunodetection des protéines d’intérêt et par microscopie de fluorescence.
L’identification des gènes impliqués dans la biosynthèse anaérobie de UQ sera réalisée grâce à une approche génétique, par génomique comparative, ou par une approche biochimique incluant la purification du complexe putatif anaérobique de biosynthèse de UQ et l’établissement de sa composition par analyse protéomique.
Nous étudierons l’importance physiologique de UQ synthétisée en conditions anaérobies/microaérobies grâce à des expériences de compétition entre des souches sauvage et mutantes d’E. coli privées d’UQ.

La caractérisation biochimique de UbiJ et UbiK a été réalisée et a permis de démontrer que les 2 protéines forment un hétérotrimère (UbiK2-UbiJ1) et qu’UbiJ pouvait lier l’acide palmitoléique, un lipide endogène d’E. coli. Ces résultats ont été publiés en juin 2017 avec la description de l’implication du nouveau gène ubiK dans la biosynthèse aérobie de UQ chez E. coli.
Nous avons montré que de nombreuses protéines Ubi co-migrent à environ 1 MDa sur gel BN-PAGE. La microscopie de fluorescence a permis de détecter uniquement certaines protéines Ubi et a montré que ces protéines co-localisaient dans la cellule. Ces résultats sont en accord avec l’existence d’un complexe multiprotéique participant à la synthèse aérobie de UQ et nous tentons maintenant de purifier ce complexe et d’établir sa composition.
Grâce à une approche génétique, nous avons identifié deux nouveaux gènes de fonction inconnue qui sont essentiels à la biosynthèse de UQ en anaérobie. Nous suspectons que ces protéines pourraient catalyser les étapes d’hydroxylation de la biosynthèse anaérobie de UQ. Nous essayons actuellement de purifier ces protéines et de mettre en place des tests d’activité afin de préciser leur fonction.
Concernant la fonction de UQ en anaérobie, nous avons réfuté la proposition de Sauer et Sevin selon laquelle UQ participe à la stabilité des membranes d’E. coli et à sa résistance au stress osmotique en conditions aérobies (Nat Chem Biol, 2014). En effet, contrairement à ces auteurs, nous n’avons pas observé de sensibilité au NaCl de plusieurs mutants déficient en UQ ni en aérobie ni en anaérobie. Nous allons dorénavant nous concentrer sur l’étude d’autres fonctions potentielles de UQ en anaérobie comme sa contribution à la respiration microaérobique.

Nous pensons que les hydroxylases de la voie de biosynthèse anaérobie d’E. coli pourraient appartenir à une nouvelle classe d’enzyme capable de catalyser des réactions d’hydroxylation en absence de dioxygène. La découverte et la caractérisation de telles enzymes, probablement largement répandues chez les microorganismes anaérobies, pourrait ouvrir de nouvelles voies dans le développement de catalyseurs d’hydroxylation respectant les principes de la chimie verte.
En caractérisant la dynamique de la biosynthèse de UQ en anaérobie, son organisation et son importance physiologique, nous contribuerons à obtenir une meilleure compréhension du métabolisme microaérobie-anaérobie d’une large classe de protéobactéries, dont plusieurs sont virulentes. Nos travaux précédents démontrant l’importance de l’UQ pour la virulence de Salmonella en conditions aérobies laissent penser UQ pourrait également être un facteur de virulence en anaérobie. Si tel était le cas, notre identification de gènes - non conservés chez l’homme - impliqués dans la biosynthèse anaérobie de UQ pourrait ouvrir des pistes pour le développement de nouveau antibactériens.

Loiseau, L., Fyfe, C., Aussel, L., Hajj Chehade, M., Hernandez, S.B., Faivre, B., et al. (2017). The UbiK protein is an accessory factor necessary for bacterial ubiquinone (UQ) biosynthesis and forms a complex with the UQ biogenesis factor UbiJ. J Biol Chem. doi: 10.1074/jbc.M117.789164.

Pelosi, L., Ducluzeau, A.L., Loiseau, L., Barras, F., Schneider, D., Junier, I., et al. (2016). Evolution of Ubiquinone Biosynthesis: Multiple Proteobacterial Enzymes with Various Regioselectivities To Catalyze Three Contiguous Aromatic Hydroxylation Reactions. mSystems 1(4), e00091-00016. doi: 10.1128/mSystems.00091-16.

La respiration est un processus biologique essentiel car le gradient électrochimique qu’elle génère de part et d’autre des membranes est utilisé pour la production d’énergie et le transport actif. Les quinones jouent un rôle clé comme transporteurs d’électrons et de protons dans les chaînes respiratoires. Chez la bactérie modèle Escherichia coli, le pool de quinones est constitué d’ubiquinone (UQ) utilisée essentiellement dans la respiration aérobie et de deux naphtoquinones principalement impliquées dans la respiration anaérobie. En plus de la respiration, les quinones sont impliquées dans d’autres fonctions cellulaires importantes comme la formation de ponts disulfures à l’intérieur des protéines, la régulation transcriptionnelle, la lutte contre certaines formes réactives de l’oxygène et la stabilisation des membranes.

La biosynthèse d’UQ est un processus complexe, incomplètement caractérisé, qui nécessite au moins 11 protéines. E. coli synthétise UQ aussi bien dans des conditions de croissance aérobie qu’anaérobie. Nos travaux récents sur la voie biosynthétique aérobie ont permis de préciser la fonction de certaines protéines de biosynthèse d’UQ et de découvrir de nouvelles protéines (JBC in 2013 and J Bacteriol. in 2014). Tout semble indiquer que ces protéines agissent de façon concertée au sein d’un complexe protéique. La biosynthèse et les rôles physiologiques d’UQ en conditions anaérobie et microaérobie sont moins documentés malgré le fait que ces conditions soient fréquemment rencontrées par E. coli dans différentes niches écologiques. Si certains acteurs protéiques participent aux deux voies de biosynthèse d’UQ, nos résultats préliminaires indiquent que plusieurs acteurs protéiques sont spécifiques de la voie aérobie ou de la voie anaérobie. Notre projet a pour but d’accéder à une compréhension détaillée et intégrée de la biosynthèse d’UQ chez E. coli en conditions aérobies et anaérobies et de tester l’importance physiologique de l’UQ pour diverses fonctions cellulaires dans des cultures de laboratoires ainsi que pour la colonisation de différents hôtes. Afin d’atteindre ce but, les trois partenaires emploieront une approche pluridisciplinaire incluant : (i) la génétique et physiologie des microorganismes ; (ii) la biologie moléculaire et l’imagerie cellulaire ; (iii) la chimie des protéines et la biologie structurale ainsi que la synthèse organique.

Nous focaliserons nos études biochimiques et structurales sur les protéines Ubi que nous avons récemment identifiées afin d’établir leur fonction. Deux de ces protéines sont spécifiques de la voie aérobie et une de la voie anaérobie. Nous éluciderons leur contribution au remodelage de la biosynthèse d’UQ qui prend place entre des conditions aérobies et anaérobies. Nous chercherons en particulier à confirmer l’existence et à mieux caractériser un complexe regroupant plusieurs protéines Ubi. La biosynthèse d’UQ nécessite des étapes d’hydroxylation du noyau aromatique. Dans des conditions aérobies, cette réaction utilise l’oxygène moléculaire comme source d’atomes d’oxygène. Dans ce projet, nous proposons plusieurs approches indépendantes pour identifier, pour la première fois, les hydroxylases anaérobies de la biosynthèse d’UQ qui catalysent des réactions d’hydroxylation indépendamment de l’oxygène. Des enzymes de cette classe existent probablement chez les microorganismes anaérobies stricts mais n’ont pas encore été identifiées ni caractérisées. Finalement, afin de mieux appréhender les fonctions remplies par UQ, nous proposons des expériences in vivo basées sur la comparaison des phénotypes de mutants de la synthèse aérobie et/ou anaérobie d’UQ chez E. coli. L’ensemble de nos résultats élucidera les raisons pour lesquelles E. coli produit UQ aussi bien en présence qu’en absence de dioxygène et les moyens qu’elle a développés pour cela.