Gels supramoléculaires orientés pour le guidage de cellules souches neurales – NEURAXE

Trois compétences clés ont été mises en œuvre. Le point de départ est la conception et la synthèse d'une famille de molécules capables de s'auto-assembler pour former des fibres assurant la formation de gels. Les hydrogels ont ensuite été utilisés comme supports de culture de neurones. La biocompatibilité simple a été réalisée par des tests de viabilité avec des lignées cellulaires neuronales. La colonisation en 3D, à l'intérieur de l'hydrogel a été montrée par microscopie confocale. Ensuite, la culture de cellules souches neurales adultes humaines a été réalisée. Des méthodes ont été spécifiquement mises au point pour réussir à observer et identifier les cellules dans ces gels très fragiles. Enfin, différents outils de mise en forme des gels sont évalués, tels que le filage en voie humide et l'impression 3D.

Une famille de quatorze molécules gélifiantes à tête saccharidique a été synthétisée. Les conditions de gélification et les gels ont été caractérisés par différentes méthodes physicochimiques. La biocompatibilité de sept d'entre elle a été évaluée, avec de bons résultats en termes de viabilité cellulaire. La culture de cellules souches neurales humaines adultes sur les nouveaux hydrogels mis au point ont montré que les cellules souches se développent en sept jours en un réseau dense de neurones et de cellules gliales. En outre, les neurones développent de nombreux neurites guidés par les fibres de gel moléculaire. On a observé notamment la formation d'un réseau mixte de neurites, avec des faisceaux de neurites rectilignes très longs ayant suivi les fibres droites et larges du gélifiant et d'autres neurites plus courts de morphologie non rectiligne. Ensuite, on a mis au point une méthode permettant de mettre en forme ces hydrogels par extrusion. L'injection d'une solution de gélifiant dans l'eau entraîne sa coagulation au contact de l'eau. Selon le dispositif, on forme alors des bobines de filaments de gel, par filage en voie humide ou bien des petites architectures imprimées en 3D, par impression 3D. Cette technique permet de mettre en forme les gélifiants de façon très précise et plus facile que par voie thermique. En outre, de façon remarquable, lors du filage en voie humide, les fibres supramoléculaires de gélifiants se sont organisées de façon radiale au sein du filament de gel. Cette organisation particulière révèle la diffusion radiale de l'eau au cours du procédé de gélification.

La famille de gélifiants saccharidiques et les techniques de mise en forme qui ont été développées dans ce projet ouvrent des perspectives très intéressantes dans le domaine des matériaux et hydrogels supports pour culture cellulaire. En effet, il s'agit de molécules synthétiques, pures, de structures parfaitement définies, reproductibles et biocompatibles. En outre, une méthode d'impression 3D permet de construire des architectures bien précises avec ces hydrogels. Ces molécules nouvelles présentent donc des perspectives importantes dans le domaine de la bioimpression 3D et de l'ingénierie tissulaire.

1- «A Shear-Induced Network of Aligned Wormlike Micelles in a Sugar-Based Molecular Gel. From Gelation to Biocompatibility Assays«. J. Fitremann, B. Lonetti, E. Fratini, I. Fabing, B. Payré, C. Boulé, I. Loubinoux, L. Vaysse, L. Oriol, Journal of Colloid and Interface Science, 2017, 504, 721–730.

2- «Simple synthetic molecular hydrogels from self-assembling alkylgalactonamides as scaffold for 3D neuronal cell growth«. A. Chalard, L. Vaysse, P. Joseph, L. Malaquin, S.Souleille, B. Lonetti, J.-C. Sol, I. Loubinoux, J. Fitremann, ACS Applied Materials and Interfaces, 2018, 10, 17004-17017.

3- Chalard, A.; Joseph, P.; Souleille, S.; Lonetti, B.; Saffon-Merceron, N.; Loubinoux, I.; Vaysse, L.; Malaquin, L.; Fitremann, J. Wet Spinning and Radial Self-Assembly of a Carbohydrate Low Molecular Weight Gelator into Well Organized Hydrogel Filaments. Nanoscale 2019, 11 (32), 15043–15056.

4- Chalard, A.; Mauduit, M. ; Souleille, S.; Joseph, P.; Malaquin, L.; Fitremann, J. 3D printing of a biocompatible low molecular weight supramolecular hydrogel by dimethylsulfoxide - water solvent exchange. Additive Manufacturing 2020, 33, 101162.

5- Production de la N-heptyl-D-galactonamide de grade biologique (licence)

6. Communiqué de presse national CNRS «Une nouvelle molécule gélifiante pour la culture de neurones en 3D«, 14 mai 2018.

15 communications orales dans des congrès nationaux et internationaux

Les accidents vasculaires cérébraux ou les lésions traumatiques du système nerveux conduisent à une perte importante de neurones et à des handicaps marqués. Un des défis actuels dans le domaine de l'ingénierie tissulaire consiste à réaliser des implants permettant une bonne survie des cellules neuronales implantées d'une part, et d'autre part, capables d'orienter la croissance des cellules neuronales dans une direction privilégiée, de façon à reconnecter plus efficacement les zones séparées par la lésion. L'objectif final du projet est d'injecter in vivo des hydrogels orientés chargés en cellules souches neuronales humaines et de démontrer qu'ils guident la croissance des neurones dans une direction privilégiée et améliorent la récupération des fonctions motrices, la vitesse et la qualité de la guérison.

Dans ce but, une première étape consiste à concevoir et préparer des hydrogels pour la culture cellulaire en 3D basés sur des hydrogélifiants supramoléculaires de faible masse molaire. Ces gélifiants forment par auto-assemblage des fibres qui s'enchevêtrent et qui soutiennent la formation d'hydrogels viscoélastiques. Leurs propriétés mécaniques et rhéologiques diffèrent de celles des hydrogels à base de polymère et en ce sens, peuvent mimer de plus près les propriétés de la matrice extracellulaire. Dans certains cas, ils montrent aussi une restructuration rapide du gel après cisaillement, comme peuvent le faire les matériaux "auto-cicatrisants". Pour cette raison, ils pourraient également mieux répondre aux exigences techniques dans les applications en tant que matrices injectables et ils pourraient être plus adaptés comme support de culture 3D par rapport aux gels de polymères. Comparé aux quelques rares hydrogels déjà commercialisés pour la culture cellulaire en 3D et l'injectabilité et basés sur ce type de gélifiants de faible masse molaire, qui sont des peptides très chers, un premier objectif est de concevoir et de synthétiser des gélifiants de faible masse molaire biocompatibles appartenant une autre famille de molécules. Nous déterminerons leur biocompatibilité et leurs propriétés rhéologiques, en relation avec leur utilisation en tant que matrice de culture cellulaire en 3D in vitro et en tant que matrice injectable pour l'application in vivo.

De façon à induire la croissance orientée des neurones, différentes méthodes pour orienter les fibres supramoléculaires seront mises en œuvre. L'objectif est de mieux contrôler l'auto-assemblage des molécules dissociées en fibres, de façon à obtenir des objets auto-assemblés fibrillaires mieux définis et mieux organisés entre eux, et d'obtenir plus particulièrement des fibres alignées. On mettra en œuvre des dispositifs specifiques permettant de contrôler l'alignement et les déclencheurs de la gélification.

Finalement, les gels non orientés ou orientés seront testés in vitro pour la culture de cellules nerveuses, y compris des cellules souches nerveuses humaines. La cytotoxicité, la croissance, l'adhésion et la différenciation cellulaire seront étudiées. Finalement, la capacité des gels orientés à guider la croissance de neurites dans une direction privilégiée sera estimée. La réalisation finale sera de tester, dans le cas des gels ayant donné les meilleurs résultats in vitro, s'ils peuvent être injectés et orientés in vivo. Les résultats en terme de récupération fonctionnelle et de reconstruction tissulaire seront étudiés.