TMOL - Technologie Moléculaire pour des Matériaux Fonctionnels

Technologies moléculaires pour des architectures repliées hybrides – COFFIT

Technologies moléculaires pour des architectures replies hybrids peptides-foldamères

Les chimistes ont développé divers oligomères synthétiques “les foldamères” ayant une propension au repliement. Les foldamères ouvrent des perspectives en design moléculaire mais ne peuvent être soumis aux méthodes d’évolution dirigée des biopolymères qui permettent l’émergence rapide de fonctions au sein d’aptamères peptidiques ou nucléotidiques. Ce projet vise à lever ces limites en combinant les technologies de synthèse de foldamères avec celles de traduction in vitro de peptides.

Combinaison d’oligomères synthétiques repliés (foldamères aromatiques) avec des peptides exprimés par traduction ribosomale d’ARNm

Ce projet interdisciplinaire proposait de développer une nouvelle technologie moléculaire qui combine les avantages de la grande stabilité conformationelle et la prévisibilité des structures repliées de foldamères amides aromatiques, avec ceux de l’expression et de la sélection de peptides in vitro grâce aux technologies de « Traduction flexible in vitro (FIT) » et de « Découverte intégrée de séquences peptidiques aléatoires (RaPID) ». Le projet a permis de démontrer la capacité d’hélices stables de foldamères d’induire le repliement de courts peptides. De façon remarquable, il a été découvert que le ribosome tolère la présence de foldamères attachés au peptide durant la traduction de séquences d’ARNm en peptides. Le bénéfice de la présence de foldamères étant qu’ils portent une information de repliement. Ces résultats ouvrent la voie à l’évolution dirigée d’hybrides foldamère-peptide avec l’idée qu’un tel hybride pourra avoir des propriétés hors de portée d’un peptide seul ou d’un foldamère seul. Ceci pourrait ainsi permettre l’identification de ligands basés sur ces hybrides pour des cibles difficiles à des fins diagnostiques ou thérapeutiques.

Le travail conjoint a requis la mise en oeuvre de la synthèse organique chimique de différents foldamères capables de se replier en hélice, chacun lié à un acide aminé. La ligation de cet acide aminé portant un foldamère à un ARNt a ensuite été effectuée, suivie de la production ribosomale de peptides intégrant cet acide aminé. La spectrométrie de masse a permis de vérifier dans de nombreux cas la bonne intégration dans le peptide de l’acide aminé portant le foldamère. Ces structures hybrides ont ensuite été synthétisées séparément par voie chimique sur une plus grande échelle et leur structure a été élucidée par différentes spectroscopies et par cristallographie des rayons X.

Une série de foldamères ayant des longueurs et des propensions à se replier en hélice variables ont été préparés et attachés à un ARNt par le biais d’un acide aminé. Quand cet ARNt est utilisé comme unité d’initiation lors de la traduction in vitro de peptides, les peptides produits intègrent avec succès le foldamère à leur extrémité N-terminale. Les études ont ensuite montré la possibilité d’intégrer des foldamères attachés à une chaine latérale de peptide en milieu de séquence. Le bénéfice d’intégrer un foldamère au peptide vient de ce qu’il apporte une information de repliement qui permet le contrôle de la conformation du peptide comme il a été démontré dans des hybrides foldamères-peptides cycliques. Ces résultats vont bien au-delà de ce qu’on attendait au début du projet et démontrent la haute tolérance du ribosome pour des entités non peptidiques. Les peptides constituent des molécules biologiquement actives typiques mais ils ont aussi des limitations intrinsèques comme leur faible biodisponibilité et leur rapide biodégradation. Il est attendu que des hybrides foldamères-peptides offrent des possibilités d’application là où des peptides seuls ou des foldamères seuls ne fonctionneraient pas, et aussi que l’expression ribosomale de ces hybrides accélère les processus de découvertes.

L’extension de la gamme d’entités chimiques qui peuvent être produites par le ribosome peut permettre d’accélérer la découverte de molécules munies de fonctions pour lesquelles de courts peptides non repliés sont mal adaptés. La découverte que le ribosome accepte des objets beaucoup plus grands et distincts des peptides qu’imaginé précédemment a de larges implications. Elle invite à poursuivre l’exploration des aptitudes du ribosome et est prometteuse pour des applications futures, par exemple diagnostiques ou thérapeutiques.

La production scientifique au terme du projet inclut un article intitulé “Ribosomal synthesis and folding of peptide-helical aromatic foldamer hybrids“, impliquant les deux partenaires de façon égale, accepté pour publication dans la revue in Nature Chemi

Objectifs
Ce projet interdisciplinaire vise à développer une nouvelle technologie moléculaire combinant le bénéfice des hautes stabilité et prévisibilité des structures repliées de foldamères amide aromatique et la puissance de l’expression in vitro de peptides par les systèmes « Flexible In-vitro Translation (FIT) » et « Random nonstandard Peptide Integrated Discovery (RaPID) ».
Le projet comprend quatre objectifs spécifiques: 1°) Démonstration de principe du repliement de peptides induit par un foldamère. L’évolution dirigée de peptides produira des ligands pour des cibles foldamères. Les structures des peptides liés seront élucidées; 2°) Mise au défi de la traduction ribosomale d’ARNm en peptides liés par liaison covalente à un foldamère servant à induire le repliement, et évolution dirigée de telles structures hybrides foldamère-peptide; 3°) Incorporation de monomères aromatiques dans des peptides par traduction ribosomale d’ARNm. Dans des expériences déterminantes, nous explorerons la possibilité d’incorporer des unités non naturelles pouvant induire un repliement dans des peptides produits par expression in vitro. 4°) Mise en place de fonctions dans des architectures hybrides foldamère-peptide: nouveaux ligands pour l’hydroxyapatite (HA) et le collagène. Les objectifs 1-3 visent tous à construire des hybrides qui, du fait de leur repliement induit, sont de meilleurs candidats pour lier une cible réputée difficile, comme le minéral HA ou la protéine collagène, impliqués dans la régénération des os et des tissus.

Valeur ajoutée à l’état de l’art
Nous développerons des protocoles pour combiner la synthèse chimique de foldamères et l’expression in vitro de peptides pour produire des architectures repliées hybrides fonctionnelles. Peu de tentatives existent de telles combinaisons. Le concept d’utiliser un foldamère entier pour induire le repliement d’un peptide est nouveau. Nos progrès dans cette direction devraient produite une science innovante dans le domaine des architectures moléculaires repliées avec des applications potentielles pour la réparation et la régénération des os et des tissus. Au-delà de ces cibles, notre technologie pour produire des architectures hybrides devrait être utile dans une vaste gamme de contextes académiques et industriels.

Approche technique
Tâche 1 : des foldamères amides aromatiques produits par synthèse sur support solide serviront de cible pour l’évolution dirigée de peptides par les méthodes FIT et RaPID. Les motifs d’association des peptides aux foldamères seront élucidés par RMN et cristallographie. Ces peptides seront combinés à d’autres séquences peptidiques pouvant lier HA ou le collagène. Tâche 2 : de courtes séquences foldamères seront incorporées dans des peptides par la méthode FIT pour induire le repliement des hybrides ainsi produits. L’évolution dirigée de ces hybrides sera conduite pour identifier des ligands de HA ou du collagène. Tâche 3 : des monomères aromatiques seront synthétisés et la possibilité de leur incorporation dans une séquence peptidique par expression ribosomale sera étudiée. Ces séquences seront ciblées vers HA ou le collagène.

Résultats attendus
Chaque tâche apporte un incrément de difficulté mais aussi un impact potentiel croissant. Les résultats attendus incluent : (i) l’identification et la caractérisation de complexes hybrides foldamère-peptide avec des groupes fonctionnels divergeant; (ii) la démonstration que des foldamères amide aromatique peuvent induire le repliement de peptides moyens; (iii) la traduction in vitro et la sélection de peptides ayant un foldamère lié covalemment; (iv) possiblement, l’expression ribosomale d’acides delta-aminé au sein de séquence peptidiques ; (v) des hybrides foldamères-peptide capable de lier HA ou le collagène et de servir de « colle moléculaire » pour la réparation et la régénération des os et des tissus.

Coordinateur du projet

Madame Céline DOUAT (Chimie et Biologie des Membrances et Nano-Objets - CNRS-Univ. Bordeaux-INP)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

The University of Tokyo Bioorganic Chemistry Lab, Department of Chemistry, Graduate School of Science
CBMN-CNRS Chimie et Biologie des Membrances et Nano-Objets - CNRS-Univ. Bordeaux-INP

Aide de l'ANR 225 564 euros
Début et durée du projet scientifique : novembre 2014 - 36 Mois

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