DS0504 - Enjeux de santé

Protéomique pour de nouveaux biomarqueurs en écotoxicologie chez les gammares: challenge de la biodiversité et immunoanalyse multiplexée comme outil de diagnostic – ProteoGam

La biologie moléculaire offre l’impossible pour la surveillance des milieux aquatiques

Les nouvelles approches moléculaires, comme la protéogénomique, offrent aujourd’hui la possibilité de découvrir et d’identifier de nombreuses protéines chez des espèces non modèles mais d’intérêt fort pour la surveillance des milieux. Identifier et comprendre les perturbations endocrines chez les amphipodes est désormais possible

Un outil spécifique, multiplexé et transférable pour la perturbation endocrine

Les enjeux du projet sont de lever les verrous scientifiques et techniques limitant l’utilisation des biomarqueurs chez les invertébrés, comme les crustacés amphipodes, pour la surveillance des milieux aquatiques. Le premier objectif consiste à identifier des protéines d’intérêt, en évaluant d’une part leur spécificité mâle ou femelle et d’autre part en décrivant leur profil au cours du cycle de reproduction afin de valider leur fonction physiologique. Le second a pour ambition d’intégrer la diversité spécifique, les divergences moléculaires et de séquences des protéines d’intérêt entre espèces, ceci afin de proposer des méthodes de mesures des biomarqueurs transférables chez les gammaridés. Ce point permettra notamment de se garantir que la mesure soit spécifique pour chaque espèce, et ainsi de pouvoir évaluer la vulnérabilité des espèces ou populations à la contamination. Enfin le dernier objectif, traite en partie d’une limite technique forte à l’utilisation des biomarqueurs qui est le développement de méthodes multiplexées. A l’aide de la méthodologie Luminex®, l’objectif est de développer une approche immunoassay et mutiplexée permettant l’identification et la quantification de plusieurs peptides protéotypiques (spécifiques des protéines d’intérêt) en une seule analyse

L’identification des protéines d’intérêt et sexe-spécifiques, ainsi que leur validation physiologique ont été possibles en croisant d’une part les connaissances en physiologie et écophysiologie que l’on disposait chez le gammare et l’utilisation du protéome précédemment défini chez G. fossarum et d’autres part nos compétences en spectrométrie de masse haute résolution. L’approche innovante protéogénomique, couplant l’étude simultanée du transcriptome et du protéome pour un tissu cible ou chez un organisme cible, va être mise en oeuvre pour diverses espèces de gammare, ceci dans le but d’une part de produire une base de données protéiques pour chaque espèce étudiée et d’autre part d’identifier les séquences conservées et proposer des peptides protéotypiques « universels » entre espèces pour chaque protéine d’intérêt. Le projet sera également l’occasion, pour la première fois en science environnementale, de développer une approche analytique innovante pour la mesure des biomarqueurs. L’objectif est de proposer une méthode par immunoassay, mais également multiplexée. L’innovation réside d’une part dans le développement d’anticorps dirigés contre des peptides protéotypiques et dans le développement de l’approche Luminex® qui permet d’identifier et quantifier spécifiquement des anticorps présents en mélange. Enfin, et d’un point de vue méthodologie, il est proposé d’utiliser une approche de surveillance active (encagement d’organisme) dans le but d’évaluer la pertinence pour chaque biomarqueur retenu et de lui associer une référence intégrant sa variabilité naturelle au regard des facteurs environnementaux autres que la contamination

Les premiers résultats de ces travaux ont permis d’identifier des protéines d’intérêt comme biomarqueurs de perturbations endocriniennes chez notre espèce sentinelle G. fossarum. Pour quatre de ces protéines, des anticorps spécifiques dirigés contre les peptides protéotypiques ont été obtenus et ont permis de développer une méthode de dosage, aujourd’hui en multiplex, de ces protéines. Dans le même temps, les travaux sur le protéome de G. fossarum ont conduit à la mise en place d’une nouvelle collaboration avec A. Salvador (ISA-Lyon), ayant permis de développer des approches en spectrométrie de masse pour de la quantification de protéines d’intérêt. Les travaux menés ont permis, pour la première fois, de valider la preuve de concept d’une telle approche chez un invertébré aquatique et ont donné lieu à la proposition d’une méthode spécifique pour la mesure de biomarqueurs couramment utilisés en écotoxicologie aquatique et ce de façon multipléxée.

Les sorties de ce projet sont d’un intérêt majeur pour le suivi de la contamination chimique et de la toxicité des milieux, notamment dans le cadre de la DCE. Ces travaux permettront de répondre à un manque crucial d’outils pour évaluer les effets des perturbateurs endocriniens dans les milieux et vis-à-vis des invertébrés, alors que des observations soupçonnant fortement leur présence existent. Les résultats de ces travaux doivent alimenter la démarche de transfert des outils d’écotoxicologie pour leur utilisation dans la surveillance, via la recommandation des acteurs de l’eau.

Les premiers résultats de ce projet ont été très bien valorisés, au travers de six publications internationales, un chapitre d’ouvrage et six communications en congrès

L’étude de la perturbation endocrinienne chez les invertébrés aquatiques est une problématique d’actualité. Plusieurs groupes d’experts, nationaux et européens, ont récemment rappelé la nécessité de développer chez les invertébrés des outils pour identifier les modes d’action impliqués dans les effets toxiques observés sur des fonctions physiologiques clefs, comme la reproduction. Malgré l’importance des gammares dans le fonctionnement des écosystèmes aquatiques, leur très large utilisation en écotoxicologie (en laboratoire et sur le terrain) et les divers marqueurs de toxicité disponibles, aucun biomarqueur spécifique de perturbations endocriniennes (PE) n’est actuellement validé comme outil de diagnostic pour ces espèces. Ce constat résulte du manque crucial de connaissances sur la régulation endocrinienne de la reproduction chez les amphipodes, et de données génomiques chez les espèces non-modèles. Récemment, nous avons proposé une nouvelle démarche combinant les approches génomiques et protéomiques (appelée protéogénomique) comme stratégie pour la découverte de protéines chez des espèces non-modèles. Pour la première fois, cette approche a été conduite chez un macro-invertébré, notre espèce sentinelle Gammarus fossarum. Ces travaux ont permis d’acquérir de la connaissance sur l’écophysiologie moléculaire de la reproduction chez cette espèce, à travers la découverte de nouvelles protéines clés. A l’aide des nouvelles approches omiques, le projet ProteoGam propose une démarche de rupture pour le développement d’une nouvelle génération de biomarqueurs chez les invertébrés et leur utilisation pour la surveillance.
Le premier objectif de ProteoGam est de développer des biomarqueurs de PE chez G. fossarum dans le but d’améliorer l’évaluation de la toxicité des milieux aquatiques. Le second objectif est de développer des méthodes analytiques transférables, « universelles », pour la mesure des biomarqueurs de PE proposés chez G. fossarum. Cette étape permettra d’aborder l’étude de la vulnérabilité des gammares aux PE et d’évaluer la pertinence de G. fossarum comme espèce cible. Parallèlement, une nouvelle approche, basée sur la technologie Luminex xMAP® va être mise en place pour la quantification des biomarqueurs. Cette méthode permet à l’aide d’anticorps de quantifier, de façon multiplexée, plusieurs protéines en une seule analyse, en se basant sur la quantification de peptides protéolytiques spécifiques pour chaque biomarqueur.
A l’aide du transcriptome disponible sur notre population de référence de G. fossarum, les protéines spécifiques de l’appareil reproducteur mâle et femelle seront identifiées, parmi lesquelles les candidats biomarqueurs de PE seront proposées en fonction de (i) leur profil au cours du cycle de reproduction, défini par une analyse protéomique comparative, et (ii) leur sensibilité vis à vis de molécules modèles et lors d’expérimentations sur le terrain. Pour évaluer la pertinence de G. fossarum comme espèce représentative des gammares au regard de leur sensibilité aux PE, une analyse protéogénomique sera réalisée sur 5 des espèces les plus rencontrées en France et en Europe : G. fossarum, G. pulex, G roeseli, G. tigrinus et Dikerogammarus villosus. Le protéome des ovaires et testicules sera déterminé pour chacune des espèces et interprété à l’aide d’un transcriptome associé (RNAseq). Cette approche permettra de sélectionner une série de peptides spécifiques des protéines d’intérêt comme biomarqueurs de PE chez G. fossarum, mais également conservés chez les différentes espèces étudiées, et ainsi de proposer des biomarqueurs « universels » chez les gammares.
ProteoGam permettra donc i) d’acquérir des connaissances sur l’écophysiologie de G. fossarum et les protéines clefs de la reproduction, ii) d’illustrer la pertinence des approches omiques dans le développement de biomarqueurs, et iii) de proposer une méthode multiplexée rendant possible l’utilisation des biomarqueurs comme outils de diagnostic.

Coordinateur du projet

Monsieur Olivier Geffard (Irstea, UR MAEP, laboratoire d'écotoxicologie)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Irstea-UR MAEP Irstea, UR MAEP, laboratoire d'écotoxicologie
CEA DSV-iBEB-SBTN-LBSP, laboratoire de biochimie des systèmes perturbés
ICN CNRS Institut de Chimie de Nice

Aide de l'ANR 444 523 euros
Début et durée du projet scientifique : janvier 2015 - 48 Mois

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