Validation pré-clinique des hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes pour la biothérapie hépatique – StemHepTher

Des lignées de cellules souches embryonnaires (ES) humaines de grade GMP sont évaluées sur leur capacité à se différencier en hépatocytes selon nos procédés de production GMP consistant à induite une différenciation des cellules ES humaines en cellules de l'endoderme puis en hépatocytes progéniteurs (pStemHep). La qualité de la différenciation est évaluée sur l'expression de marqueurs hépatiques (HNF4, AFP, etc...) et la perte d'expression des marqueurs de pluripotence par une analyse RT-qPCR, immunofluorescence et FACS.
Le potentiel thérapeutique des pStemHep sera évalué chez le rat modélisant le Crigler-Najjar, le rat Gunn.
Pour avoir une première validation thérapeutique, nous avons d'abord mis au point un modèle de rat Gunn immunosupprimés par du tacrolimus et nous avons utilisé des cellules souches pluripotentes humaines de grade recherche.
Le rat Gunn est immunosupprimé par une injection journalière de tacrolimus et est transplanté avec des pStemHep dans le foie via la rate. L'efficacité thérapeutique est évaluée par la mesure du taux de bilirubine dans le sang.

Nous avons identifié une lignée de cellules ES GMP capable de se différencier en hépatocytes selon nos procédés de production.
Chez le rat Gunn immunosupprimé par du tacrolimus et injection de pStemHep issus de cellules souches pluripotentes de grade recherche, nous avons observé une diminution significative de la bilirubinémie (30 %) à long-terme (5 mois). Ce qui est équivalent aux cellules gold standard, les hépatocytes isolés d'un foie humain.

Nous avons maintenant établi des conditions robustes pour la production des hépatocytes à partir de la lignée de cellules souches pluripotentes humaines que nous avons généré à partir de fibroblastes de macaques.

Nous avons établi une liste d’inclusion et d’exclusion pour les patients atteints du Crigler-Najjar. A ce jour nous avons identifié 16 patients potentiels. Nous avons participé à la création d’un registre des patients Crigler-Najjar.

Les perspectives sont de produire des hépatocytes à partir des cellules ES GMP sélectionnées et de tester leur potentiel thérapeutique pour traiter le Crigler-Najjar, mais aussi une autre maladie orpheline, l' insuffisance hépatique aiguë que nous modélisons chez la souris par une intoxication au paracétamol.
Nous allons constituer un banque de cellules ES GMP selon nos spécifications.
Nous allons aussi marquer nos hépatocytes simiens en faisant exprimer la protéine GFP et le facteur IX humain ; ce qui permettra de suivre la fonctionnalité in vivo de ces hépatocytes après transplantation dans le foie de macaques.

.Brevet Inserm n°EP 15 305 265.9, « Use of laminines for differentiating pluripotent stem cells into hepatic cells lineage »).

Articles:
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2. Ménoret S, Tesson L, Remy S, Usal C, Ouisse LH, Brusselle L, Chenouard V, Nguyen TH, David L, Anegon I. Transgenic animals and genetic engineering techniques. Nantes, France, 2-3 July, 2015. Transgenic Res. 2015 Dec;24(6):1079-85.
3. Blasimme A, Anegon I, Concordet JP, De Vos J, Dubart-Kupperschmitt A, Fellous M, Fouchet P, Frydman N, Giovannangeli C, Jouannet P, Serre JL, Steffann J, Rial-Sebbag E, Thomsen M, Cambon-Thomsen A. Genome Editing and Dialogic Responsibility: «What's in a Name?«. Am J Bioeth. 2015 Dec;15(12):54-7.
4. Hannoun Z, Steichen C*, Dianat N*, Weber A, Dubart-Kupperschmitt A. The Potential of Induced Pluripotent Stem Cell derived Hepatocytes. J Hepatol, 2016, 10.1016/j.jhep.2016.02.025, in press
5. Pourcher G, El-Kehdy H, Kanso F, Groyer-Picard MT, Gaillard M, Trassard O, Blazsek I, Agostini H, Dubart-Kupperschmitt A*, Dagher I*. Volumetric Portal Embolization: A New Concept to Improve Liver Regeneration and Hepatocyte Engraftment. Transplantation. 2016, 2016 Feb;100(2):344-54.
6. Tolosa L, Caron J, Hannoun Z, Antoni M, López S, Burks D, Castell JV, Weber A, Gomez-Lechon MJ*, Dubart-Kupperschmitt A.* Transplantation of hESC-derived hepatocytes protects mice from liver injury. Stem Cell Res Ther. 2015 Dec 12;6(1):246. doi: 10.1186/s13287-015-0227-6.
7. Dianat, N., Dubois-Pot-Schneider, H., Steichen, C., Desterke, C., Leclerc, P., Raveux, A., Combettes, L., Weber, A., Corlu, Dubart-Kupperschmitt, A.* Generation of functional cholangiocyte-like cells from human pluripotent stem cells and HepaRG cells. Hepatology 2014 60, 700-14.4.

La greffe de foie est l’unique traitement curatif pour des maladies métaboliques monogéniques sévères et des insuffisances hépatiques aigües. Cependant, il y a une pénurie de donneurs et un nombre croissant de patients meurt dans l’attente d’une greffe hépatique.

Notre objectif est de développer l'application clinique des souches embryonnaires humaines (CSEh) et cellules souches pluripotents induites humaines (CSPih) différenciées en hépatocytes, les cellules responsables du métabolisme hépatique. Le rationnel de notre approche de médecine régénérative est basé sur les essais cliniques montrant que la transplantation d'hépatocytes allogéniques est une solution thérapeutique prometteuse pour remplacer la greffe de foie. Des bénéfices thérapeutiques ont été observés chez certains patients ayant reçu une transplantation d‘hépatocytes. Toutefois, entre 2 et 5 milliards d’hépatocytes doivent être transplantés pour améliorer la fonction métabolique déficiente chez le patient. Mais, la transplantation d’hépatocytes est limitée par le manque de foies donneurs qui sont priorisés pour la greffe de foie. En outre, les hépatocytes ne peuvent pas être amplifiées in vitro. Ceci souligne le besoin crucial de développer de nouvelles sources capables de produire en masse des d'hépatocytes.

Les souches pluripotents (CSEh, CSPih) peuvent s’auto-renouveler et se différencier en hépatocytes fonctionnels (pStemHep) in vitro qui s’implantent dans le foie de souris. Cependant, leur application clinique se heurte à de grands défis. Tout d'abord, des différences notables entre les lignées de cellules souches pluripotentes ont été observées en termes de différenciation hépatique. Jusqu’à présent les résultats ont été obtenus avec des CSEh de grade recherche dont la qualité est insuffisante pour une application clinique. Ainsi, la production d’hépatocytes à partir de CSEh de grade GMP (Bonnes Pratiques de Fabrication) qui est la qualité pour la fabrication d’un médicament, reste à accomplir. Des CPSih de grade GMP doivent aussi être générées. Par ailleurs, les souris immunodéficientes avec une atteinte hépatique aiguë ont été les modèles utilisés pour prouver le potentiel thérapeutique des pStemHep. Cependant, ces modèles ne sont pas pertinents pour les maladies héréditaires du foie, ce qui nécessite de développer des modèles animaux appropriés. En effet, pour ces maladies, les hépatocytes doivent se greffer dans le foie et être fonctionnels à long terme alors que pour les hépatites aigües, il s’agit de soutenir transitoirement les fonctions hépatiques et la régénération du foie.

Ainsi, les objectifs spécifiques de ce projet sont les suivants:
1. Constituer une banque de qualité GMP d’hépatocytes issues des CSEh répondant aux critères de qualité pour une utilisation chez l’Homme
2. Générer des CPSih de qualité GMP et validées pour leur capacité de différentiation hépatique
3. Effectuer des études d'efficacité et de biosécurité dans un modèle de rongeur atteint d’une maladie métabolique hépatique (Crigler-Najjar) que nous développerons
4. Montrer que des hépatocytes différenciés à partir de cellules souches de primates non humains se greffent à long terme dans le foie d’animaux receveurs immunosupprimés avec une efficacité suffisante pour s'attendre à des bénéfices thérapeutiques chez les patients. Dans ce modèle animal, le plus proche de l'Homme pour la physiologie et l’anatomie du foie, nous utiliserons le protocole de transplantation mis au point au laboratoire, applicable en clinique, qui permet d’atteindre une prise de greffe de 5-10% après injection de 400 millions de cellules.
5. Créer une base de données de patients afin d'identifier et de suivre ceux qui seraient éligibles à une thérapie cellulaire dans le foie et accélérer ainsi l’application clinique de notre approche de médecine régénérative.