DS0401 - Une nouvelle représentation du vivant

Rôle des facteurs parasitaires dans le trafic rétrograde et la virulence de Toxoplasma gondii – APISORTING

Rôle des facteurs parasitaires dans le trafic rétrograde et la virulence de Toxoma gondii

Decipher how the sorting receptor TgSORTLR and its cytosolic binding partners can play key roles for protein trafficking and sorting to apical organelles of Toxoplasma gondii.

Enjeux et objectif

The phylum Apicomplexa comprises a large group of obligate intracellular parasites of wide human and agricultural significance. Most notable is Plasmodium spp., the causative agents of malaria, and Toxoplasma gondii, responsible for diseases of the developing fetus and immune compromised individuals. Rhoptry (ROP), microneme (MIC) and dense granules (DG) proteins are essential secreted factors regulating invasion and survival of T.gondii into the host cell. During parasite division, these proteins are de novo synthetized and targeted to their final destination by a mechanism of vesicular budding from the Golgi apparatus. We have recently identified key trafficking regulators involved in the differential sorting and transport of ROP, MIC and DG proteins towards their final respective secretory organelles, such as the unique receptor TgSORTLR. We found that TgSORTLR is essential for host cell egress, gliding motility, cell invasion and in vivo virulence in mice. We now propose a collaborative project between three teams headed by Drs Ludger Johannes (Institut Curie, Paris), Alain Van Dorsselaer (CNRS UMR 7178, University of Strasbourg) and Sabrina Marion (CIIL, CNRS UMR 8204-INSERM U 1019, Pasteur Institute of Lille) that will decipher how TgSORTLR and its cytosolic binding partners can play key roles for protein trafficking and sorting to apical organelles. Our project will examine the detailed molecular mechanisms regulating endolysosomal-like vesicle formation and transport that can be exploited to understand the biogenesis of the key parasite-specific secretory organelles that are essential for parasite virulence and pathogenesis.

Molecular biology, cell biology, molecular genetics.

We directed our first investigations towards the achievement of Tasks 1-3 of the APISORTING project.
Task 1: We have developed a quantitative LC-SRM approach on six selected proteins that specifically co-immunopurified with the retromer proteins (Vps26, Vps29 and Vps35).
Task 2: In 2012, we have developed a vectorial proteomics approach to determine the proteome of the retrograde trafficking route in a given cell type. Using ANR funding for a proof of concept study, we have now identified alpha5beta1 integrin as a new retrograde cargo protein. This work has been published in 2016 in Nature Cell Biology.
Task 3: To study the biogenesis of secretory organelles in Toxoplasma gondii, we have focused on two proteins: the clathrin adaptor AP1, and the Vps35 protein of retromer. We found that AP1 regulates the differential sorting of ROP and MIC proteins. This data are currently submitted for publication. We have also characterized the retromer complex protein Vps35. These findings have recently been published in Nature Communications.

To transpose our advances to the retrograde trafficking process of Toxoplasma gondii, a post-doctoral fellow (Maika Deffieu) has been recruited with ANR funding for a duration of 24 months. She will start in September 2016.

Sangaré LO, Alayi TD, Westermann B, Hovasse A, Sindikubwabo F, Callebaut I, Werkmeister E, Lafont F, Slomianny C, Hakimi MA, Van Dorsselaer A, Schaeffer-Reiss C, Tomavo S. Unconventional endosome-like compartment and retromer complex in Toxoplasma gondii

Les parasites apicomplexes regroupent près de 5000 espèces de protozoaires intracellulaires stricts causant généralement la mort de l’individu ou des animaux infectés. Ces apicomplexes parmi lesquels sont représentés Plasmodium falciparum, l’agent responsable du paludisme et Toxoplasma gondii, l’un des parasites les plus ubiquitaires chez les mammifères, incluent également des agents opportunistes dangereux pour les patients atteints du SIDA ou des agents classés du bioterrorisme. Les apicomplexes ont comme dénominateur commun et caractéristique unique, la présence de trois organites apicaux sécrétoires: les rhoptries, les micronèmes et les granules denses. Ces organites contiennent des facteurs de virulence qui sont indispensables pour la motilité parasitaire, la reconnaissance et l’entrée du parasite à l’intérieur de la cellule hôte, ainsi que dans la modulation de la réponse immune et du métabolisme de l’hôte infecté. Les récepteurs qui sont responsables du tri et du transport des protéines présentes dans ces organites ne sont pas encore connus. Les mécanismes moléculaires impliqués dans la biogenèse de ces organites spécifiques aux apicomplexes sont également inconnus. Nous avons récemment identifié et caractérisé un récepteur putatif nommé TgSORTLR ("Toxoplasma gondii Sortilin-Like Receptor") et mis en évidence un rôle unique pour ce récepteur dans l’adressage des protéines des rhoptries et micronèmes vers les organites sécrétoires. TgSORTLR est présent chez tous les apicomplexes et sa séquence protéique conservée possède des domaines uniques non retrouvés chez les autres Eucaryotes. Nous avons généré un mutant conditionnel TgSORTLR qui a conduit aux conséquences physiologiques délétères suivantes: 1) absence complète de la biogénèse des rhoptries et micronèmes durant la réplication parasitaire, 2) inhibition totale de l'invasion des cellules humaines causée par l’absence des organites sécrétoires, 3) perte complète de virulence du parasite dans un modèle d’infection de souris (absence de symptômes toxoplasmiques après injection des parasites). De plus, nous avons démontré que la délétion de l’extrémité cytoplasmique C-terminale de TgSORTLR entraîne un effet dominant négatif létal pour le parasite, indiquant que l’absence du peptide C-terminal seul suffit pour compromettre l’acheminement des protéines de rhoptries et micronèmes et la survie du parasite. Nous avons maintenant utilisé cette extrémité cytoplasmique pour identifier puis isoler les protéines majeures VPS35, VPS26 et VPS29 du complexe retromer impliqué dans le transport rétrograde entre endosomes et appareil de Golgi. Nous avons récemment obtenu un mutant conditionnel du gène VPS35 qui conduit également à la délocalisation des protéines des rhoptries et micronèmes puis en l’absence complète de ces deux organites apicaux. Nous avons également produit des parasites transgéniques exprimant VPS35 et VPS26 étiquetées avec l’épitope HA, ce qui nous a permis de construire le réseau de protéines impliquées dans le transport rétrograde chez T. gondii. Notre projet de recherche vise maintenant à disséquer les mécanismes moléculaires de trafic rétrograde impliquant des protéines connues et d’autres qui totalement inédites avec des fonctions actuellement inconnues dans les mammifères et la levure. Nous utiliserons des approches biochimiques (protéomiques vectorielle et quantitative), de biologie cellulaire (imageries confocale et ultrastructurale) et de génétique inverse (création de mutants ou parasites transgéniques) afin d’élucider les fonctions biologiques du retromer VPS35 et de ses partenaires de fonctions connues et inconnues. En conclusion, ces travaux pourront apporter des connaissances fondamentales sur les fonctions du transport rétrograde dans la biogenèse des organites apicaux sécrétoires mais pourraient également avoir un impact important dans le développement futur de nouvelles approches thérapeutiques antiparasitaires.

Coordinateur du projet

Monsieur Ludger Johannes (INSTITUT CURIE CENTRE DE RECHERCHE)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CIIL Centre d'infection et d'immunité de Lille
IC INSTITUT CURIE CENTRE DE RECHERCHE
IPHC- UMR7178 Institut Plurisdiciplinaire Hubert Curien- Laboratoire de Spectrométrie de Masse Bioorganique- UMR 7178
IBIC Insitut de Biologie Intégrative de la Cellule

Aide de l'ANR 498 576 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2014 - 48 Mois

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