DS0401 - Une nouvelle représentation du vivant

Nouvelles approches multimodales pour l’étude dynamique de macrophages humains individuels à l’échelle nanométrique – MACRONANO

MACRONANO : Etude multimodale des MACROphages humains à l'échelle NANOmétrique

Les objectifs du projet sont cognitifs et technologiques. Nous souhaitons accroître notre connaissance des propriétés mécaniques des macrophages humains mais aussi développer de nouvelles méthodes pour mesurer les forces de protusion à l'échelle sub-cellulaire et leur dynamique temporelle. Nous fabriquerons également des systèmes microfabriqués pour étudier ces propriétés mécaniques, la migration cellulaire et l'organisation des podosomes au sein de micro-environements artificiels.

Propriétés mécaniques des macrophages humains à l'échelle nano

Les podosomes sont des sortes de pieds multiples par lesquels la cellule contacte son environnement suggérant ainsi leur rôle dans la migration. Quelquefois appelés invadosomes lorsqu’ils sont présents au sein de cellules cancéreuses, ces complexes d’adhésion de taille submicronique constituent une cible pharmacologique d’intérêt. En effet, les podosomes des macrophages peuvent être essentiels au fonctionnement du système immunitaire, mais aussi délétères lorsqu’ils sont impliqués dans la migration des cellules cancéreuses. La connaissance de l’organisation spatiale 3D des podosomes en lien avec leur activité mécanique de protrusion au sein du micro-environnement de la cellule, permettrait d’élaborer des pistes d’action dans le but de contrôler à façon la migration cellulaire. <br />Nous avons donc développer dans ce projet une méthode assez unique qui couple une méthode d’imagerie optique super-résolue (3D-Storm) et une méthode de mesure mécanique à l’échelle nanométrique la « protusion force microscopy » (PFM), inspirée du microscope à force atomique. Grâce à la résolution spatiale de ces deux méthodes nous avons pu établir un lien direct entre l’organisation des molécules au sein du complexe d’adhésion et la force mécanique locale générée. En particulier, le rôle exact des principales protéines de la mécano-transduction (Taline, vinculine, paxilline) a été élucidé. Nous avons montré la tension mécanique au sein du podosome qui combinée à la polymérisation d’un cœur d’actine permet la génération d’une force de poussée de quelques nano-newtons oscillante dans le temps. L’analyse dynamique de ces forces de poussées au sein d’un réseau de podosomes nous a permis de montrer que des podosomes voisins sont synchronisés en phase.

Nous avons conçu et fabriqué des dispositifs de micro-fluidiques permettant la mesure quantitative des forces cellulaires exercées lors de la migration de macrophages humains vivants confinés au sein de micro-canaux . Des piliers déformables en PDMS ont été intégrés au sein de ces canaux afin de mesurer ces forces en plusieurs points. Le suivi spatio-temporel de la position de ces piliers nous a permis de chiffrer l’évolution des forces au cours d’une séquence migratoire. Le module et la direction vectorielle des forces appliquées par la cellule ont pu être enregistrés de manière simultanée. Ce type de dispositif fournit des informations précieuses sur le couplage entre l’activité mécanique de la cellule (génération de forces) et la fonction de migration (sens et vitesse de déplacement) au sein d’un espace confiné, représentatif des configurations rencontrées au sein des microenvironnements in-vivo. Nos résultats montrent la fonctionnalité de ces dispositifs capables de mesurer des forces de 4 nN avec une précision d’environ 0.4 nN. A l’aide d’une deuxième approche nous avons tenté de mesurer ces forces de migration au sein d’un véritable environnement 3D. Pour cela nous avons fabriqué des échafaudages tridimensionnels par lithographie optique à deux photons. Nous avons généré des objets périodiques de réseau cubique avec un paramètre de maille compris entre 5 et 20 microns. Nous avons observé que les macrophages humains sont capables de pénétrer au sein de ces structures de résine. Il nous a été possible de suivre en imagerie la déformation des poutres du réseau ainsi que le déplacement des nœuds du réseau au cours de la migration d’une cellule.

Etude de l’organisation spatiale des protéines de la mécano-transduction des podosomes

Nous avons mis en oeuvre une méthode multi-modale de corrélation entre l’imagerie des forces de protrusions par microscopie à force atomique (AFM) et l’imagerie optique 3D super-résolue. Nous avons ainsi pu établir la relation entre l’organisation moléculaire des podosomes et leur fonction mécanique avec une résolution encore jamais atteinte. Le rôle des 3 protéines clefs (Taline, Vinculine, Paxiline) a été établi et nous montrons qu’elles sont toutes impliquées dans la génération de la force et également de manière assez inattendue pour la polymérisation de l’actine contre le substrat.. Ceci montre que le complexe d’adhésion est sous tension et coopère avec la polymérisation d’actine au cœur du podosome pour générer la force de poussée.

Observation et modélisation de l’activité dynamique du réseau de podosomes
Grâce à notre méthode d’imagerie directe de ces forces de protrusion nous avons pu étudier en détail la dynamique temporelle de ces poussées mécaniques. Nous nous sommes intéressés dans un premier temps à des podosomes individuels puis à un ensemble de podosomes voisins afin d’étudier leur possible synchronisation mécanique. Nous avons découvert que des podosmes voisins présentent une synchronisation de phase dans leur poussée mécanique. Pour cela nous avons d’abord établi un modèle mécanique aux éléments finis afin de relier simplement la force de poussée et la déformation induite sur une membrane élastique à partir de la géométrie représentative d’un podosome obtenue par une combinaison d’imagerie optique en immunofluorescence et par microscopie électronique à balayage. Ensuite nous avons développé un algorithme afin de mesurer la force générée par un ensemble de podosomes à partir de séquences d’images AFM. Nous montrons plusieurs exemples de corrélations temporelles entre la poussée mécanique de podosomes premiers voisins.

Les différentes méthodes mises en place au cours du projet MACRONANO vont être exploitées afin d'étudier d'autres cellules présentant un intérêt thérapeutique. Ainsi les ostéoclastes seront analysés par 3D storm et par PFM afin de révéler l'organisation particulière de leurs podosomes sous la forme d'une couronnes définissant une zone de scellement sous la cellule.

La migration cellulaire en 3D au sein de structures imprimées à 3D sera poursuivie sur des lignées de cellules cancéreuses de caractère invasive variable.

1. Protusion force Microscopy reveals oscillatory force generation and mechanosensing activity of human macrophage podosomes, A. Labernadie, A. Bouissou, P. Delobelle, S. Balor, R. Voituriez, A. Proag, I ; Fourquaux, C. Thibault, C. Vieu, R. Poincloux, GM Charrière and I. Maridonneau-Parini, Nat. Comm. (5) 2014

2. Working together: spatial synchrony in the force and actin dynamics of podosome first neighbors, A. Proag, A. Bouissou, T. Mangeat, R. Voituriez, P. Delobelle, C. Thibault, C. Vieu, I. Maridonneau-Parini, R. Poincloux, ACS nano,9,4,3800-3813, (2015)


3. Evaluation of the force and spatial dynamics of macrophage podosomes by multiple particle tracking, A. Proag, A. Bouissou, C. Vieu, I.Maridonneau-Parini and R. Poincloux, Methods 94, 75-84 (2016)

4. (4) Podosome force generation machinery : a local balance between protusion at the core and traction at the ring, , A. Bouissou, A. Proag, N. Bourg, K. Pringis, C. Cabriel, S. Balor, T. Mangeat, C. Thibault, C. Vieu, G. Dupuis, E. Fort, S. Lévêque-Fort, I. Maridonneau-Parini and R. Poincloux, ACS Nano 11(4) 4028-4040 (2017)

Les macrophages sont capables d’infiltrer tous les tissus d’un organisme, quelles que soient leurs compositions, rigidités ou architectures. Cette étape est critique pour leur fonction immuno-protectrice, mais elle est aussi associée à l’aggravation de pathologies chroniques. C’est pourquoi le contrôle de la migration des macrophages apparait comme un nouveau défi thérapeutique. Nous avons montré précédemment que la migration 3D mésenchymateuse des macrophages implique leurs structures d’adhérence: les podosomes qui constituent des cibles potentielles dans le cadre de nouvelles approches thérapeutiques visant à contrôler la migration des macrophages. Les podosomes sont des structures sub-micrométriques qui se présentent sous la forme d’un cœur d’actine filamentaire entouré d’un anneau composé de protéines d’adhérence, les intégrines, et de protéines connectant les intégrines au cytosquelette. Les podosomes sont interconnectés par un réseau radial de microfilaments d’actine, et sont suspectés de sentir la rigidité de l’environnement (« mechanosensing »), via l’application de forces de protrusion. Ces forces n’ont jamais pu être mesurées, du fait de l’absence de méthode dédiée à la mesure de forces perpendiculaires à un substrat. Ainsi, la compréhension des mécanismes impliqués dans l’activité de mechanosensing à l’échelle du podosome nécessite l’émergence de nouvelles technologies dotées d’une haute résolution spatiale, à l’interface entre la biologie et la physique.

Nous avons récemment développé une méthode dédiée à l’évaluation des forces de protrusion générées par des podosomes, que nous avons appelée « Protrusion Force Microscopy » (PFM). Elle consiste en la mesure, par microscopie à force atomique, des déformations produites par les podosomes dans une membrane de Formvar. Grâce à la PFM, nous avons pu montrer que chaque podosome exerce une force oscillatoire d’environ 90nN (Labernadie et al, en révision).

Maintenant, notre objectif consiste à développer de nouvelles méthodologies basées sur les nanotechnologies pour étudier plus en détails l’activité de mechanosensing des macrophages. Le projet comprend 4 volets :
- L’identification des protéines de l’anneau impliquées dans la production de force par les podosomes mesurée par PFM ;
- L’étude des propriétés de mechanosensing des podosomes, en créant des motifs de rigidités contrôlées dans une membrane de Formvar par abrasion ionique (FIB) et en mesurant la force des podosomes par PFM sur ces surfaces;
- L’étude du rôle de l’organisation des podosomes en réseau, qui sera contrôlée en faisant adhérer des macrophages sur des motifs de protéines de matrice extracellulaire dessinés par lithographie douce;

L’étude de la mécanique des macrophages dans une structure 3D dessinée par lithographie bi-photonique 3D.Le modèle théorique que nous avons élaboré afin d’expliquer les forces oscillatoires générées par un podosome isolé sera complété avec les résultats sur les régulateurs présents dans l’anneau des podosomes, les câbles latéraux et l’organisation des podosomes en réseau.

Les résultats de ce projet nécessiteront une analyse selon des perspectives biologiques et technologiques. De fait, d’une part nous allons générer des résultats quantitatifs originaux sur la mécanique et les propriétés de mechanosensing des macrophages humains et d’autre part, nous allons valider une technologie applicable pour différents modèles cellulaires permettant l’étude dynamique (en temps réel), multimodale et quantitative des forces de protrusion. Pour atteindre ces objectifs, nous allons utiliser plusieurs méthodes issues des nanosciences: microscopie de force atomique en milieu liquide, lithographie douce, l’imagerie en force atomique (AFM) en milieu liquide, la lithographie douce, la gravure localisée par faisceaux d’ions focalisés, la lithographie 3D à deux photons et la microscopie de fluorescence en réflexion totale interne (TIRF).

Coordinateur du projet

Monsieur Christophe Vieu (Laboratoire d'Analyses et d'Architecture des Systèmes)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

LAAS-CNRS Laboratoire d'Analyses et d'Architecture des Systèmes
IPBS Institut de Pharmacologie et de Biologie Strcuturale
LJP Laboratoire Jean Perrin

Aide de l'ANR 471 372 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2014 - 42 Mois

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