DS0404 - Innovation biomédicale

La Spécification hématopoïétique dans l'embryon humain: vers de novo génération de cellules souches hématopoïétiques – ACEBLOOD

Comprendre la formation du sang in vivo: vers une production à visée thérapeutique in vitro

L'objectif de la proposition ACEBLOOD est d'améliorer la compréhension des événements cellulaires et moléculaires conduisant à la spécification et à l'activation d'un programme hématopoïétique au cours du développement embryonnaire.

Les programmes génétiques à la base de la génération de cellules souches hématopoïétiques

La génération de cellules sanguines tout au long de la vie repose sur l’existence de cellules souches hématopoïétiques générées au cours de l’embryogenèse. Ces cellules sont multipotentes, capables d'autorenouvellement à long terme et peuvent être greffées aux patients atteints de maladies du sang héréditaires ou acquises. Cependant, la disponibilité de donneurs immuno-compatibles reste un problème majeur. Malgré les progrès réalisés au cours de la dernière décennie dans la recherche de sources alternatives pour remédier à cette pénurie, la reprogrammation de cellules pluripotentes ne conduit qu'à la génération in vitro de progéniteurs dont les capacités d'autorenouvellement et de multipotence restent limitées. <br />L'objectif de la proposition ACEBLOOD est d'améliorer la compréhension des événements cellulaires et moléculaires conduisant à la spécification et à l'activation d'un programme hématopoïétique au cours du développement embryonnaire. En effet, une compréhension plus claire de la signalisation embryonnaire et des processus morphogénétiques pourrait suggérer des facteurs moléculaires supplémentaires qui pourraient rendre le «processus de reprogrammation« plus robuste et efficace et donc ouvrir sur la possibilité de générer et d'amplifier les CSH in vitro. <br /> Sur la base de ces hypothèses, notre projet présente l'adéquation parfaite au défi sociétal de développer une approche de thérapie génique et cellulaire spécifique à la maladie et au patient, un des objectifs majeurs en médecine régénérative.

Le partenaire 1 a montré la capacité des CSH, transduites par le vecteur lentiviral, à garder leur multipotence et à ainsi proliférer et à se différencier in vitro. Il a mis au point les méthodes de dissociation enzymatiques qui permettent d'obtenir des cellules isolées à partir de tissus embryonnaires. Enfin, en association avec la plateforme Microarray & Sequencing et Bioinformatics, il a défini la stratégie pour effectuer une analyse bioinformatique de cellules rares isolées d'embryons humains.
Le partenaire 2 a amélioré les conditions de transplantation de cellules humaines dans l'embryon de poisson zèbre. Différents milieux de culture ont été comparés afin de trouver le meilleur compromis permettant la survie des cellules humaines ainsi que du poisson, réduisant l'incidence mortalité des embryons en ajoutant un cocktail d'antibiotiques et définissant la température optimale d'incubation. Enfin, il a optimisé une imagerie in vivo pendant une semaine afin de suivre le sort des cellules transplantées sans compromettre le développement et la survie de l'embryon du poisson.
Le partenaire 3 a mis en place les conditions permettant une transduction rapide par les vecteurs lentiviraux des CSH afin de les rendre fluorescentes. Ce point est très crucial, car une culture prolongée de CSH peut conduire à une différenciation in vitro. De plus, les vecteurs ont été conçus de manière à exprimer une variante nucléaire de la GFP sous le contrôle d'un promoteur fort (CMV dans la version finale, EF1-a dans la version initiale). Enfin, il a défini les conditions optimales permettant un marquage efficace des cellules humaines avec un MOI (multiplicité d'infections) le plus bas possible, un point crucial car un MOI faible entraînera un marquage inefficace tandis qu'un MOI élevé, conduisant à l'intégration de plusieurs copies du génome rétroviral, peut conduire à une mutagénèse insertionnelle indésirable de nombreux gènes, modifiant éventuellement le comportement des CSH transduites

(a) En premier lieu, afin de visualiser les cellules transplantées dans des embryons de poisson zèbre, nous avons développé une méthode rapide de transduction lentivirale. Nous avons ensuite greffé des cellules transduites dans des embryons de poisson zèbre et décrypté la raison de l'échec de la greffe. Nous avons ainsi établi des conditions pour des greffes hématopoïétiques reproductibles. Nos résultats ont démontré pour la première fois que le succès de la greffe hématopoïétique dépend de déplétion des macrophages primitifs du poisson zèbre.
(b) Deuxièmement, sur la base d'une analyse transcriptomique, nous avons identifié que le gène COTL1 - connu pour être impliqué dans la synthèse des leucotriènes - est exprimé dans les CSH intra-aortiques, ainsi que dans les progéniteurs hématopoïétiques du sac vitellin au cours du développement chez l'embryon humain. Ce résultat ouvre la voie pour explorer davantage le rôle des leucotriènes dans la spécification hématopoïétique.

Il n'y a aucun doute que ces résultats seront évalués par
- la rédaction de 3 articles scientifiques. Le premier sera soumis prochainement
- la présentation aux congrès scientifiques
Un travail très important décrivant comment isoler les CSH d'embryons humains a été établi.
Le marquage stable des CSH humaines par un lentivirus ainsi que la démonstration de la conservation de leur totipotence est également établi.
Nous avons démontré l'intérêt d'utiliser un modèle alternatif, l'embryon de poisson zèbre, un modèle éthiquement accepté par les autorités réglementaires et qui remplace l'utilisation de modèles mammifères tels que les souris et les rats. Sa transparence permet une surveillance en temps réel du comportement et du devenir des cellules souches. Ce travail est en cours et permettra l'étude d'autres cellules souches à des fins thérapeutiques.
Enfin, un grand nombre de gènes a été identifié et ouvre de nouvelles perspectives pour l'étude de l'émergence et du devenir des CSH humaines in vitro.
La découverte que le COTL, un gène impliqué dans la production des leucotriènes, est exprimé dans tous les sites hémogéniques au cours du développement embryonnaire, comme l'AGM et le sac vitellin, est particulièrement intéressante.
Bien que préliminaires, ces résultats sont très encourageants et incitent à une analyse plus approfondie visant à développer une approche pharmacologique de la perte et du gain de fonction pour étudier le rôle de la synthèse des leucotriènes dans l'émergence hématopoïétique.

Une partie de ces résultats a été présentée sous forme de «poster« lors de plusieurs réunions scientifiques nationales et internationales.
Ces travaux font l'objet de trois articles scientifiques en cours de finalisation pour publication.


La production continue de cellules sanguines tout au long de la vie repose sur l'existence de cellules souches hématopoïétiques (CSH) générées au cours de l’embryogenèse. Ces cellules sont une composante de la moelle osseuse et sont greffées aux patients atteints de maladies du sang héréditaires et acquises. Cependant, il est à noter que la disponibilité des donneurs immuno-compatibles reste un problème. L'échec de la greffe, le syndrome de réaction du greffon contre l'hôte et la reconstitution retardée restent des causes importantes de morbidité et de mortalité après une greffe de moelle osseuse.
Récemment, la possibilité d'activer des gènes primitifs multipotents dans des cellules humaines adultes a permis le retour à un état primitif des cellules (dites cellules souches pluripotentes, iPS), a ouvert de nouvelles perspectives dans le domaine de la médecine régénérative. La production in vitro de cellules souches hématopoïétiques à partir de cellules iPS pourrait fournir une source de cellules transplantables pour le traitement de l'anémie falciforme, la thalassémie, la leucémie et d'autres maladies augmentant également la possibilité d'une transplantation autologue. Bien que la production de certains types de cellules hématopoïétiques pour des applications spécifiques soit en train de devenir possible, générer un nombre conséquent de CSH capables d'auto - renouvellement à long terme et à fort potentiel reste impossible jusqu'à présent. Ceci suggère que les connaissances des mécanismes clés de spécification ou différentiation restent peu inconnues.
Comprendre comment se produit la spécification des CSH cours du développement embryonnaire et en essayer de reproduire rigoureusement ces événements est un moyen de développer des techniques améliorées pour les protocoles de différenciation dirigés. Les CSH adultes sont d'abord générées dans la région "aorte - gonades – mésonéphros" (AGM) entre les jours 27 et 40 du développement embryonnaire chez l'Homme, mais une capacité à générer des cellules hématopoïétiques est déjà présent à des stades plus précoces dans la splanchnopleure (Sp ) – la région présomptive de l'aorte hématogène. L'origine des cellules sanguines a fait l'objet d'intenses débats scientifiques au cours de la dernière décennie. Bien qu'il soit relativement bien accepté que les premières CSH sont produites dans l'AGM à partir d'un endothélium hémogénique , une processus conservés au cours de l'évolution, le précurseur direct de ce type de cellules dans l'embryon , soit un mésenchyme ou un hémangioblaste, reste à être clairement identifiés .
Ici, nous examinons l'origine cellulaire des CSH dans l'embryon humain. L'étude se concentre sur l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) pour laquelle nous avons montré qu’elle représentait un marqueur des pré-CSH dans l’embryon précoce. Le potentiel et le devenir des cellules ACE + seront ici analysées par culture cellulaire in vitro et in vivo par la transplantation dans l’embryon de poisson zèbre. Le profil du d'expression des cellules ACE+ sera également caractérisé. Avec la compréhension de ces processus, se profile la découverte de nouveaux facteurs capables de promouvoir l’induction des CSH et/ou leur expansion.

Coordinateur du projet

Madame Manuela Tavian (UMR-S949 INSERM Université de Strasbourg)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UM2 UMR5235 - DIMNP Dynamique des interactions membranaires normales et patholgiques
INSERM UMR-S949 UMR-S949 INSERM Université de Strasbourg
CNRS UPR 9002 Retroviruses and Molecular Evolution CNRS-UPR 9002 Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire

Aide de l'ANR 404 220 euros
Début et durée du projet scientifique : octobre 2014 - 36 Mois

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