DS0401 - Une nouvelle représentation du vivant

Mécanismes des voies fidèles de tolérance des lésions – GENOBLOCK

Tolérance aux dommages de l'ADN

Etude de la génétique et des mécanismes moléculaires des voies fidèles de tolérance des lésions de l'ADN.

Comprendre comment est régulé le choix entre voie fidèle et voie mutagène de tolérance des lésions

Nous avons deux objectifs principaux: 1) Poursuivre l'étude génétique de la tolérance aux dommages de l'ADN et la compréhension des mécanismes moléculaires du DA chez la bactérie. Cette étude nous permettra de mieux comprendre la structure de la fourche de réplication qui rencontre une lésion et par conséquent les mécanismes de tolérance des lésions. En combinant des approches moléculaires in vivo avec une approche génétique, nous allons définir les facteurs responsables des différentes structures possibles de la fourche de réplication. En particulier, nous allons identifier les facteurs impliqués dans les processus fidèles de contournement des dommages et déterminer leur impact sur la structure de la fourche de réplication. <br />2) Adapter le système aux cellules eucaryotes afin de mieux comprendre toute déréglementation dans l'équilibre entre TLS et DA qui peut conduire à l'instabilité génétique responsable de nombreuses pathologies. Grace à cette approche, nous allons pour la première fois observer les mécanismes de tolérance des lésions (à la fois TLS et DA) pour des lésions spécifiques dans le contexte chromosomique de cellules humaines. Nous serons donc en mesure de comprendre les mécanismes moléculaires de nombreuses pathologies liées à l'instabilité du génome. Ceci est très important car nous allons non seulement élargir les connaissances de base en biologie cellulaire, mais aussi car cette étude nous permettra de découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement d'une variété de maladies liées à l’instabilité génétique.

Nous avons développé une technique qui permet d'introduire une lésion unique sur le chromosome de la bactérie E. coli: un plasmide non-réplicatif portant une la lésion unique à étudier, ainsi qu'un marqueur génétique sur l'autre brin est intégré dans le génome de la cellule par le biais de la recombinase site-spécifique du phage lambda. Après intégration de la lésion, nous pouvons suivre les événements de tolérance des dommages (TLS et DA). Cette technique très robuste va être exploitée afin d'atteindre nos deux principaux objectifs.

Nous avons poursuivi l'étude génétique des voies de tolérance des dommages de l'ADN
i) en utilisant des mutants de séparation de fonction de la recombinase RecA, nous avons exploré le contrôle génétique du choix entre TLS et DA. Ainsi, nous avons pu montrer que le choix est contrôlé par l'efficacité de la recombinaison homologue. Ces résultats ont été publiés dans Nucleic Acids Research.
ii) nous avons modifié notre approche afin de visualiser l'échange de matériel génétique entre le brin endommagé et sa chromatide sœur non-endommagée. Ceci nous a permis de mettre en évidence une nouvelle stratégie de tolérance des dommages que nous avons appelé «perte de la chromatine endommagée«. Cette stratégie permet aux cellules de survivre et de se diviser au prix de la perte de l'information génétique portée par le brin d'ADN endommagé. Ces résultats ont été publiés dans Plos Genetics. Nous avons également montré l'implication de RecFOR et pour la première fois de RecBCD dans la réparation des brèches d'ADN simple brin. Ces résultats sont discutés dans un article de revue dans Current Genetics.
iii) nous avons poursuivi l'étude du rôle joué par le complexe RecBCD dans les mécanismes de réparation de brèche d'ADN simple-brin. Nous avons montré que le complexe joue un rôle dans la recombinaison homologue, mais aussi dans la TLS. L'utilisation de mutations ponctuelles affectant les activités catalytiques du complexe a montré qu'il jouait in rôle structural de protection de la fourche de réplication. Ces résultats ont été publiés dans Nucleic Acids Research (2017).
iv) Nous avons mis en évidence l'effet de la proximité de deux lésions dans les mécanismes de tolérance des dommages.
v) nous avons réussi à intégrer une lésion unique dans le génome d'une cellule eucaryote (levure) et à explorer les voies de tolérance dans cet organisme.

Nous allons poursuivre l'étude des voies de tolérance des lésions en nous attachant plus particulièrement aux aspects moléculaires des mécanismes mis en oeuvre. Nous souhaitons également réaliser des expériences de biochimie in vitro afin de confirmer les modèles issus de notre analyse génétique in vivo.
Nous allons étudier ces mécanismes dans les cellules eucaryotes en nous focalisant particulièrement sur les lésions UV dans la levure S. cerevisiae.

Laureti, L., Demol, J., Fuchs, R. P., and Pagès, V. (2015) Bacterial Proliferation: Keep Dividing and Don't Mind the Gap. PLoS Genet 11: e1005757

Pagès, V. (2016) Single-strand gap repair involves both RecF and RecBCD pathways. Curr. Genet. doi: 10.1007/s00294-016-0575-5

Naiman, K., Pagès, V., & Fuchs, R. P. (2016) A defect in homologous recombination leads to increased translesion synthesis in E. coli. Nucleic Acids Res. doi: 10.1093/nar/gkw488

Laureti, L., Lee, L., Philippin, G., & Pagès, V. (2017) A non-catalytic role of RecBCD in homology directed gap repair and translesion synthesis. Nucleic Acids Research. doi.org/10.1093/nar/gkx217

Pagès, V. and Fuchs, R.P. (2017) Inserting site specific DNA lesions into whole genomes. Methods in Molecular Biology. in press

La réplication d’un ADN endommagé est un problème universel auquel tous les organismes doivent faire face pour préserver l’intégrité de leur patrimoine génétique. Les cellules possèdent deux stratégies qui leur permettent de redémarrer une fourche de réplication bloquée : la synthèse translésionnelle (TLS) et les mécanismes de contournement des dommages (Damage Avoidance : DA). Alors que la voie de la TLS est potentiellement mutagène et la source majeure de mutations ponctuelles, les mécanismes du DA qui s’apparentent aux mécanismes de la recombinaison homologue sont eux fidèles. La TLS a été très étudiée au cours des 15 dernières années après la découverte des ADN polymérases spécialisées dites translésionnelles. Par contre, la génétique et les mécanismes moléculaires responsables de la voie du DA restent mal définis. Bien qu’il soit important de comprendre comment surviennent les mutations, il reste essentiel de comprendre les mécanismes utilisés par la cellule pour éviter ces mutations. Particulièrement dans les cellules humaines, où la mutagenèse est responsable d’instabilité génétique, elle-même responsable du vieillissement, et de nombreuses pathologies comme le cancer, des maladies neurodégénératives, etc… De plus, l’équilibre entre TLS et DA est très important puisqu’il définit le niveau de mutagenèse lors de la réplication d’un ADN endommagé.
Le but de notre projet est d'étudier le processus du DA et comment est régulée la répartition entre DA et TLS, en utilisant une méthodologie qui permet d'introduire une lésion unique à un locus spécifique dans le génome d'une cellule vivante. Nous avons récemment publié la preuve de concept et la première série de résultats (Pagès et al. NAR 2012) et montré que suite à une intégration robuste et précise d'un ADN endommagé, notre système permet pour la première fois de suivre à la fois les événements de TLS et de DA qui se produisent in vivo. Plus récemment, nous avons publié un nouvel ensemble de données (Naiman et al., PNAS 2014) où nous montrons que les événements de tolérance des lésions sont exécutées dans un ordre chronologique où la TLS se fait en premier, suivie par le DA.
Les données que nous avons obtenues jusqu'ici prouvent la robustesse de la technique et son grand potentiel que nous voulons exploiter en suivant deux objectifs principaux :
1) Poursuivre l'étude génétique de la tolérance aux dommages de l'ADN et la compréhension des mécanismes moléculaires du DA chez la bactérie. Cette étude nous permettra de mieux comprendre la structure de la fourche de réplication qui rencontre une lésion et par conséquent les mécanismes de tolérance des lésions. En combinant des approches moléculaires in vivo avec une approche génétique, nous allons définir les facteurs responsables des différentes structures possibles de la fourche de réplication. En particulier, nous allons identifier les facteurs impliqués dans les processus fidèles de contournement des dommages et déterminer leur impact sur la structure de la fourche de réplication.
2) Adapter le système aux cellules eucaryotes afin de mieux comprendre toute déréglementation dans l'équilibre entre TLS et DA qui peut conduire à l'instabilité génétique responsable de nombreuses pathologies. Grace à cette approche, nous allons pour la première fois observer les mécanismes de tolérance des lésions (à la fois TLS et DA) pour des lésions spécifiques dans le contexte chromosomique de cellules humaines. Nous serons donc en mesure de comprendre les mécanismes moléculaires de nombreuses pathologies liées à l'instabilité du génome. Ceci est très important car nous allons non seulement élargir les connaissances de base en biologie cellulaire, mais aussi car cette étude nous permettra de découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques pour le traitement d'une variété de maladies liées à l’instabilité génétique.

Coordinateur du projet

Monsieur Vincent Pagès (Centre National de la recherche Scientifique délégation Provence et Corse _ Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS DR12_UMR7258 Centre National de la recherche Scientifique délégation Provence et Corse _ Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille

Aide de l'ANR 300 000 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2014 - 48 Mois

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