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Signalisation des dommages de l'ADN étudiée par RMN in cellulo: Régulation structurale et fonctionnelle de Mdm2 par ses phosphorylations. – Mdm2-StructReg

Mdm2-StructReg

Signalisation des dommages de l'ADN étudiée par RMN in-cell: structure et régulation de Mdm2 par son état de phosphorylation.

Description de la structure de la protéine Mdm2 et des interactions intramoléculaires régulées par ses phosphorylations

Notre objectif est la caractérisation structurale de Mdm2, dans ces différents états de phosphorylation. Mdm2 est une ubiquitine-ligase, qui a pour fonction de dégrader le suppresseur de tumeur p53. L’inhibition de l’activité de Mdm2 représente donc un potentiel anticancéreux. Mdm2 contient à la fois des domaines ordonnés et désordonnés, dont les phosphorylations régulent l’activité. Cette protéine est donc très flexible et son étude structurale doit être menée dans des conditions de solvants complexes pour en comprendre le comportement structural véritable. Nous voulons décrire la structure de la protéine et les interactions intra- et intermoléculaires en fonction des états de phosphorylations et dans des conditions de solvants complexes. Cela demande des développements méthodologiques importants de spectroscopie de résonance magnétique nucléaire à haute résolution pour la caractérisation des modifications post-traductionnelles et des larges protéines désordonnées. Ces études permettront de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques anticancéreuses .

-La RMN pour les modifications post-traductionnelles:
Nous développons des protocoles pour faire de la spectroscopie RMN un outil pour l'étude des modifications post-traductionnelles des protéines intrinsèquement désordonnées. Ces protéines présentent souvent de nombreux sites de modifications qui sont utilisées pour intégrer les activités de plusieurs voies de signalisation. La RMN nous permet d'identifier l'état de modification de chacun des résidus concernés.
-La RMN in-cell:
Nous développons des protocoles utilisant la RMN qui permettent d'effectuer des études de biologie structurale dans les cellules. Une telle description est particulièrement recherchée pour les protéines contenant de larges régions désordonnées, dont le comportement structurale peut être influencé par l'environnement très encombré rencontré dans les cellules

- Les parties désordonnées de Mdm2 présentent des régions à fortes propensions de structures secondaires. Ce genre de pré-organisation structurale des régions désordonnées a souvent été observé lorsque des régions sont impliquées dans des interactions protéine-protéine. Cela serait cohérent avec nos hypothèses sur ces régions désordonnées et leur importance pour la fonction de Mdm2. Nous devons trouver quelles sont ces interactions, et si elles sont intra- ou intermoléculaires dans les mois qui viennent ;
- Nous avons développé une méthode pour résoudre la structure de protéines dans les cellules à partir de spectres RMN 2D. C’est un pas important dans le domaine de de la biologie structurale in cellulo, puisque nous avons ainsi publié la 2è structure in cellulo, la 1è depuis 2009. La méthode qui avait été décrite par nos prédécesseurs en 2009 reposait sur l’exploitation de spectres RMN 3D très longs à enregistrer, et qui demandaient de très grandes quantités de protéine (~1 mM). Elle était donc très difficile à mettre en oeuvre, et n’avait pas été réutilisée depuis par la communauté. Nous avons conçu des étiquettes paramagnétiques adéquates qui nous ont permis d’établir la structure d’une protéine modèle à 50 uM dans des cellules. Nous avons publié ces résultats en juillet dans la revue Journal of Physical Chemistry Letters (IF 8.5). Nous nous servirons de cette méthode pour décrire la structure de Mdm2 dans des solvants complexes et encombrés qui pourraient forcer des réarrangements structuraux.

- Nous voulons compléter la banque de fragments de Mdm2 pour étudier plus avant les interactions entre domaines de la protéine
- Nous voulons cartographier les sites de phosphorylations établies par les kinases les plus importantes pour la régulation de Mdm2
- Nous voulons caractériser l'influence des milieux complexes encombrés sur le comportement structural de Mdm2
-Nous voulons caractériser les interactions intra- et intermoléculaires de Mdm2
- Nous voulons vérifier que ces interactions représentent des cibles thérapeutiques en les inhibant avec des peptides dans des modèles cellulaires

Depuis le début du projet (juin 2016):
- 1 article scientifique dans le contexte du projet: Müntener, Haüssinger, Selenko, Theillet (2016) In-cell protein structure from 2D NMR experiments. J Phys Chem Lett, 7(14), 2821-2825.
- 6 articles scie

Nous voulons caractériser la structure de Mdm2 dans ses différents états de phosphorylation, et en complexe avec ses principaux partenaires. L’oncoprotéine Mdm2 est le principal régulateur du suppresseur de tumeur p53. Elle contient à la fois des domaines repliés et de larges régions désordonnées dont les phosphorylations contrôlent l’activité de la protéine entière. La structure de Mdm2 entière et après phosphorylation est inconnue. Ce projet nous donnera de plus l’occasion de développer plus avant des méthodes pour l’étude structurale de cette classe importante de protéines que constituent les protéines contenant des domaines repliés et de larges régions désordonnées.
Les protéines combinant des domaines repliés et désordonnés représentent ~30% du protéome eucaryote, et contrôlent une part importante des mécanismes de la signalisation cellulaire. Leur implication dans la pluripotence cellulaire, dans des cancers, ou des maladies neurodégénératives est très fréquente. Une meilleure description structurale de ces protéines est donc un enjeu important si l’on veut en faire des cibles thérapeutiques. Ces protéines ne sont que très rarement étudiées dans leur intégrité en biologie structurale. Leur structure globale et le contrôle de celle-ci par des modifications post-traductionnelles (PTMs) ont été très peu étudiés. De plus, le degré d’influence du milieu intracellulaire sur le comportement structural de ces protéines flexibles est inconnu. Nous proposons de franchir des étapes techniques et cognitives importantes dans ce domaine. Dans ce but, nous appliquerons sur ces protéines et développerons plus avant les méthodes que j'ai faites émerger des dernières années pour la caractérisation des PTMs par RMN et pour l'étude structurale in cellulo.
Le projet a pour objet précis de décrire les conformations adoptées par la protéine Mdm2, qui représente une cible thérapeutique majeure contre des cancers. L’activité de Mdm2 est régulée par un ensemble de phosphorylations sur ses régions désordonnées. Nous cartographierons les sites et les cinétiques de phosphorylation de la protéine. Nous décrirons ensuite les structures secondaires, tertiaires et quaternaires de Mdm2 dans les différents états de phosphorylation. Nous étudierons les effets de l’environnement intracellulaire sur la structure de cette protéine longue et flexible. Nous préciserons les contacts intermoléculaires entre Mdm2 et p53 entières. Nous vérifierons enfin l’intérêt thérapeutique des phosphorylations ou des contacts intra- et intermoléculaires identifiées.
Ce projet vise également à établir et développer, au sein des structures de recherche française, des techniques nouvelles de biologie structurale et de biochimie utilisant la spectroscopie RMN. Il demandera de plus de maintenir des collaborations fortes avec des laboratoires étrangers dont les savoir-faire sont uniques dans les domaines de la chimie des ligands de lanthanides, de la spectroscopie RPE, de la microscopie de fluorescence ou de la modélisation pour la biologie des systèmes. D’autre part, les méthodes mises en œuvre le seront avec l’ambition de les rendre utiles à l’étude de toutes les protéines comportant des domaines repliés et désordonnés, et qui subissent des modifications post-traductionnelles. C’est le cas d’un grand nombre de protéines étudiées au sein des structures d’accueil proposées, le Laboratoire de Biologie Structurale et Radiobiologie (LBSR) et le futur Institut pour la Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) de Gif-sur-Yvette.
Nous poserons ainsi des jalons techniques et de savoirs fondamentaux essentiels pour la compréhension du comportement structural de ces protéines flexibles dans un environnement scientifique adéquat. Ces nouveaux savoirs permettront de transformer les protéines intrinsèquement désordonnées d’objets d’études académiques en objets d’études à visées biomédicales.

Coordinateur du projet

Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) (Laboratoire public)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC)

Aide de l'ANR 499 940 euros
Début et durée du projet scientifique : mai 2015 - 48 Mois

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