A COmbination of systems Biology and experimental high-throughput approaches to engIneer durable Resistance against plAnt viruses in crops – COBRA

COBRA est construit autour de 5 volets transdisciplinaires et complémentaires. Dans le premier volet, les bio-informaticiens du consortium, épaulés d’un représentant de chaque partenaire de COBRA, élaborent une base de données des facteurs de la plante hôte induits ou interagissant avec les virus. Le but est ici de construire des réseaux de gènes indispensables aux virus, ceci nous permettra d’identifier in silico de nouveaux candidats pour les stratégies de résistance aux virus de plantes cultivées. Dans le volet 2, des approches de biochimie, génétique et virologie sont utilisées afin de mettre en évidence de nouveaux facteurs de la plante hôte interagissant avec les particules virales et/ou déterminants pour des étapes clefs du cycle infectieux. Nous utilisons dans ce cas la plante modèle Arabidopsis thaliana et tout nouveau gène de sensibilité identifié est transféré vers les espèces cultivées dans le cadre du volet 3 de COBRA. Le transfert est réalisé par la recherche de formes mutées de ces nouveaux gènes de sensibilité par TILLING, EcoTILLING et génétique d’association, à la fois chez l’orge, la tomate et les arbres fruitiers à noyaux. Dans le quatrième volet de COBRA, nous nous proposons d’affiner nos connaissances pour deux candidats précis, CSN5 et cPGK2, afin d’optimiser leur utilisation future comme nouveaux mécanismes de résistance aux virus. Ces deux gènes ont été validés comme gènes de sensibilité mais leur forme mutée induisant une extinction du gène n’est pas utilisable en sélection car délétère. Le but est donc de préciser quel domaine de la protéine hôte interagit avec le virus et s’il peut être découplé des autres domaines indispensables au développement normal. Le cinquième volet vise à rassembler les gènes candidats identifiés précédemment, de vérifier la stabilité et la durabilité de la résistance induite par mutation et de tester des stratégies de pyramidage afin de mettre en place une résistance plus durable aux viroses.

La banque de données créée dans COBRA regroupe des données obtenues par diverses approches (transcriptomique, protéomique, interactomique, génétique…) et donné accès à une liste de gènes impliqués dans les interactions plantes-virus. En parallèle, de nouveaux candidats identifiés en double hybride ou en génétique directe sont en cours de validation fonctionnelle via l’analyse des mutants KO correspondants. Deux gènes de sensibilité avaient été identifiés au démarrage de COBRA, cPGK2 et CSN5. Cependant l’utilisation directe de ces gènes pour la résistance est limitée car la viabilité et/ou le développement des mutants KO correspondants sont fortement altérés. Des efforts sont menés pour rechercher des formes mutées de ces facteurs non utilisables par le virus mais fonctionnelles pour la plante. Des expériences de complémentation des mutants KO par une banque de mutants ponctuels de CSN5 ou cPGK sont en cours : les lignées transgéniques présentant un développement normal sont recherchées et sont testées pour leur sensibilité aux potyvirus. En parallèle, des interacteurs viraux potentiels sont recherchés pour cPGK2 et CSN5 en système double hybride et par pull-down. Les facteurs de sensibilité identifiés dans un pathosystème donné étant transférables à des espèces cultivées, la recherche de formes mutées des facteurs CSN5, CPGK2 et PDIL est réalisée dans les espèces fruitières, la tomate et l’orge. Chez les prunus, des séries alléliques pour ces trois gènes ont été identifiées par EcoTilling et les tests de résistance à la sharka sont en cours. La même approche est menée pour CSN5 chez des mutants Tilling tomate. Trois lignées mutantes Microtom ont été auto-fécondées pour obtenir des homozygotes. Chez l’une de ces lignées, une mutation à l’origine d’un codon STOP entraine l’arrêt prématuré de la traduction et donc l’obtention d’une protéine tronquée. Ces lignées sont actuellement testées pour leur résistance au PepMoV et à d’autres virus infectant la variété Microtom.

L’utilisation de gènes de résistance est limitée par l’émergence de populations virales capables de les contourner. En particulier, les gènes de résistance récessive codent pour des facteurs cruciaux pour l’établissement du cycle viral. Des mutations dans ces facteurs sont la source de résistances chez de nombreuses plantes d’intérêt agronomique, mais peuvent être déjouées par les virus, après acquisition de mutations dans des protéines virales, permettant de rétablir une interaction compatible avec les formes mutées ou d’interagir avec d’autres facteurs de plante. Dans ce contexte, il est souhaitable d’identifier des gènes codant pour des facteurs de l’hôte qui jouent un rôle clef dans différentes étapes du cycle viral. L'association de ces nouveaux gènes de résistance aux allèles de résistance de facteurs déjà connus tels qu’eIF4E, est susceptible de présenter une meilleure efficacité et une meilleure durabilité, le virus ayant plus de difficultés à s’accommoder d’un contexte de résistance polygénique. Les travaux à venir dans COBRA visent à évaluer la durabilité des nouveaux gènes de résistance récessive identifiés en première année, seuls ou en combinaison, pour choisir les candidats à transférer vers les plantes cultivées, sur la base de la durabilité et de la stabilité de la résistance qu’ils procurent.

Communications (posters):
Arnoux X., Delmas F., German S., Walter J., Michon T. and Decroocq V. Targeting CSN5 domains to promote resistance to Plum Pox Virus in Arabidopsis thaliana. Rencontres de Virologie Végétale, Aussois, Janv 2014.
Tricon D., Faivre d’Arcier J., Eyquard J-P., Decroocq V. Search for natural variants of resistance genes to Sharka disease in Prunus species. Rencontres de Virologie Végétale, Aussois, Janv 2014.