JCJC SVSE 8 - JCJC - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

Etude de la stabilisation de l’oncogène deltaNp73-alpha par la kinase IKK-beta en utilisant une approche de Biologie Structurale Intégrative – IKKp73

Analyse structure-fonction du complexe IKKß/Dp73 impliqué dans la suppression de l'expression génique regulée par p53

La kinase IKKß phosphoryle la Ser422 de l'isoforme oncogénique deltaNp73alpha (membre de la même famille de protéines que p53 et nommé Dp73 à partir d’ici). Cette phosphorylation ponctuelle favorise la formation d’un complexe entre IKKß et Dp73, qui s’associe aux promoteurs des gènes régulés par p53 et induit la répression de l'expression génique. Le projet vise à caractériser le complexe IKKß/Dp73 en utilisant une approche de biologie structurale intégrée.

Analyse structure-fonction du complexe oncogénique IKKß/Dp73 impliqué dans la suppression de l'expression génique regulée par p53: objectifs principaux

L'inhibiteur de la kinase kB (IKK) est un régulateur crucial des réponses inflammatoires, immunitaires et apoptotiques. Il a été récemment montré que IKKß cause l’accumulation dans le noyau de Dp73, un isoforme oncogènique de p73 qui est dépourvu du domaine de transactivation N-terminal. L’accumulation de Dp73 est déclenchée par la phosphorylation de la Ser422 de Dp73 par IKKß. Cela mène à la formation d’un complexe entre IKKß et Dp73 qui, d’un côté, se lie aux promoteurs des gènes régulés par p53 et, de l’autre côté, recrute les méthyltransférase EZH2 et DNMT1. Ces gros complexes transcriptionnels comprenant IKKß, Dp73, EZH2 et DNMT1 déclenchent la méthylation de l'histone H3 et de l'ADN du promoteur, ce qui conduit à la suppression de l’expression génique. <br />Le projet vise à caractériser l'interaction entre IKKß et Dp73 en utilisant une approche de Biologie Structurale Intégrée. En particulier, le projet aborde les questions suivantes: <br />• Quelles sont les régions de surfaces de IKKß et Dp73 impliquées dans l'interaction? Quelle est la structure globale du complexe? <br />• La phosphorylation de la Ser422 semble renforcer le complexe IKKß/Dp73. Quel est le mécanisme à la base de ce phénomène? <br />• Quels sont les mécanismes d’interaction de IKKß avec Dp73 par rapport aux autres substrats (IkB et p53)? <br />• Quelle est l'influence de IKKß sur la reconnaissance spécifique des séquences ADN dans les promoteurs? <br />La compréhension de l'affinité et de la cinétique de liaison, des changements conformationnels et de surfaces moléculaires impliqués dans la formation du complexe IKKß/Dp73 permettra la conception de tests fonctionnels pour élucider le rôle de cette interaction dans la suppression de l’expression génique contrôlée par p53. Plusieurs études ont mis en évidence que les niveaux de IKKß et Dp73 augmentent dans plusieurs cancers. Pour cette raison IKKß et Dp73 représentent des cibles thérapeutiques potentiellement importantes.

Le projet fait usage d'une variété de méthodes qui sont résumées ci-dessous.

Expression des protéines en forme recombinante. Les protéines sont produites par le système d’expression baculovirus dans des cellules d'insectes, dans le cas de la protéine IKKß, et par des systèmes d’expression bactérienne, dans le cas de Dp73. Le système d’expression « cell-free » sera appliqué, si nécessaire, pour la production d’échantillons marquées pour les analyses par RMN.

Expériences d'interaction. L'interaction entre IKKß et Dp73 est analysée par des expériences de « pulldown » utilisant des protéines purifiées (voir ci-dessous) et de résonance plasmonique de surface (SPR, expériences en cours).

Tests d’activité de la kinase. Des expériences de marquage par 32P in vivo à l’aide d’un anticorps anti phospho-422S Dp73 seront effectuées. Des paramètres cinétiques seront obtenus par des expériences in vitro qui utilisent des protéines recombinantes.

Cristallographie aux rayons-X. La cristallographie aux rayons X est notre méthode de choix pour la résolution de la structure du complexe IKKß/Dp73 à haute resolution.

Spectroscopie RMN. La RMN est une technique polyvalente qui sera utilisé pour (i) evaluer le repliement des protéines; (ii) sonder les changements conformationnels; (iii) détecter les interactions par l’approche « chemical shift perturbation » (CSP); (iv) étudier la dynamique par des expériences de relaxation; (v) étudier les interfaces du complexe par CSP. Cette dernière application nécessite le marquage isotopique des échantillons.

Analyses d’interaction protéine-ADN in vivo. Des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) seront effectuées pour analyser le recrutement du complexe IKKß/Dp73 aux promoteurs des gènes.

Analyses de transcription in vivo. Nous allons transfecter des cellules Saos-2 avec des plasmides codant pour IKKß, Dp73 et p53 et suivre t’expression de la protéine endogène p21 par immunotransfert.

Le plan de recherche initialement prévu est divisé en trois parties. Aujourd’hui nous avons accompli la plupart des objectifs de la partie I et nous sommes en train de travailler sur la partie II.

Production des protéines en forme recombinante.
IKKß. La conception des constructions de IKKß est basée sur les structures 3D récemment publiées d'un grand fragment dimèrique de IKKß (résidus 1-669) comprenant les domaines KD, ULD et SDD. Nous avons exprimé la construction IKKß(1-669) dans les cellules d'insectes en utilisant le système d’expression baculovirus. La fraction soluble de l’IKKß(1-669) a été récupéré et purifié à l’aide d’une colonne Ni-NTA suivie par une étape de gel filtration. La protéine IKKß(1-669) purifiée forme un homodimère en solution (Fig. 1A).
Dp73. Nous avons conçu une série de constructions de Dp73. Chaque construction a été produite en double exemplaire, soit dans la version « wild-type » ou contenant la mutation phospho-mimétique S422E. Les résultats des essais de criblage d’expression ont montré que la totalité des constructions peut être exprimée sous forme soluble seulement en présence de l’étiquette MBP, tandis que les autres etiquettes (His6 et GST) n’ont pas permis l’expression de certaines constructions (Fig. 1B).

Etudes d'interaction
Ensuite, nous avons réalisé des expériences de « pulldown » employant les constructions MBP-Dp73 et l’IKKß(1-669) purifiée. Nous avons observé des interactions pour la plupart des constructions de Dp73, y compris ceux comprenant la mutation S422E (Fig. 1C). Ces résultats montrent que: (i) IKKß et Dp73 établissent des interactions directes et ne nécessitent pas d'autres médiateurs cellulaires pour former un complexe; (ii) le complexe IKKß/Dp73 ne se dissocie pas suite à la phosphorylation de la Ser422 et cela est en accord avec les résultats obtenus par nos collaborateurs.

Travail actuel. En ce moment nous effectuons des expériences SPR pour mieux définir l’interaction IKKß/Dp73 du pont de vue de l’affinité et de la cinétique de liaison.
En outre, nous sommes en train de préparer des échantillons marquées de Dp73 pour l'analyse par RMN avec le but de évaluer le repliement des constructions et de sonder des éventuels changements conformationnels déclenchés par la mutation S422E.

Travail futur. Dans les prochains mois, en collaboration avec R. Accardi et M. Tommasino (CIRC Lyon), nous allons effectuer des tests d'activité pour analyser la spécificité de kinase IKKß vers les différentes constructions de Dp73. L'ensemble des données sur les activités de liaison et de kinase fournira des pistes utiles pour le choix des constructions à utiliser dans les études structurales.
Nous prévoyons de commencer les essais de cristallisation sur le complexe IKKß/Dp73 au cours de l'automne. Si nous obtenons des cristaux qui diffractant de manière significative, nous allons continuer en direction de la détermination de la structure du complexe à haute résolution par la méthode des rayons-X. Dans le cas contraire, nous nous tournerons vers la cartographie des interfaces du complexe par RMN.
Dès que des informations sur les résidus impliqués dans l'interaction IKKß/Dp73 deviennent disponibles, nous allons concevoir des mutants d'interface qui seront analysés par des tests d'activités et des tests fonctionnels. Ces mutants vont servir d'outils pour étudier le rôle de l'interaction IKKß/Dp73 dans la reconnaissance des séquences ADN des promoteurs et, de manière générale, dans la suppression de l’expression génique contrôlée par p53. En outre, les mutants de IKKß seront utilisés pour étudier l’interaction de la kinase avec autres substrats (IkB et p53), ce qui nous permettra d'obtenir une vue plus globale sur la fonction d’IKKß.

Les résultats ici résumés donneront lieu à une publication

The inhibitor of kB kinase (IKK) is a regulator of inflammatory, immune and apoptotic responses, best known for its role in the activation of nuclear factor kB (NF-kB). This Ser/Thr kinase is an enzymatic complex consisting of two catalytic and one regulatory subunits. The catalytic IKKß subunit accounts for nearly all kinase activity implicated in the activation of NF-kB.
It has been proposed that IKK acts as a bridge between inflammation and cancer by operating in a number of pathways that promote tumorigenesis. A recent investigation has shown that IKKß regulates the stability of oncogenic deltaNp73-alpha. This latter protein is an isoform of p73 (a member of the tumor suppressor p53 protein family) that lacks the N-terminal transactivation domain. It exerts anti-apoptotic functions and promotes cellular transformation by competing with full-length p53 proteins for binding at p53 regulatory elements within DNA promoter regions. Massimo Tommasino and Rosita Accardi, who participate to this project, have discovered that IKKß phosphorylation at Ser422 of deltaNp73-alpha leads to the stabilization and a strong nuclear accumulation of deltaNp73-alpha and that this results in the inhibition of the expression of p53-regulated genes.
Intriguingly, the interaction between IKKß and deltaNp73-alpha appears to be enhanced by Ser422 phosphorylation. The proposed project aims at characterizing the IKKß/deltaNp73-alpha interaction using an integrated Structural Biology approach, which encompasses x-ray crystallography, NMR spectroscopy and Surface Plasmon Resonance coupled with a number of in vitro and in vivo activity assays and functional studies. Structural studies will provide three-dimensional high-resolution structures or models of IKKß/deltaNp73-alpha complexes, which will be complemented with binding kinetics and kinase activity data. Together structural and activity data will enable to elucidate the mechanisms governing this interaction. Subsequently, specific mutants of IKKß and deltaNp73-alpha will be designed based on knowledge of the interaction mechanisms. These mutants will be tested in a number functional assays in order to better define the role of the IKKß/deltaNp73-alpha interaction in nuclear accumulation of deltaNp73-alpha and subsequent inhibition of the expression of p53-regulated genes.
Both IKKß and deltaNp73-alpha have been found to be upregulated in many human malignancies, including breast, prostate, liver, lung and thyroid cancers. For this reason IKKß and deltaNp73-alpha represent potentially important therapeutic targets. We believe that the present project has the potential to unveil important mechanisms regulating cancer and therefore to be of high impact for public heath.

Coordinateur du projet

Madame Katia ZANIER (Centre National de la Recherche Scientifique-Biotechnologie et Signalisation Cellulaire) – zanier@unistra.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS-BSC Centre National de la Recherche Scientifique-Biotechnologie et Signalisation Cellulaire

Aide de l'ANR 249 999 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2013 - 42 Mois

Liens utiles

Inscrivez-vous à notre newsletter
pour recevoir nos actualités
S'inscrire à notre newsletter