Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SVSE 8 - Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

Technologie à haut débit pour la détection des nucléotides modifiés des ARN – HTRNAMod

Modification des ARN à haut débit

Technologie à haut débit pour la détection des nucléotides modifiés des ARN

Développer des techniques à haut débit pour localiser avec précision les nombreux nucléotides modifiés des ARN et mieux comprendre leurs fonctions cellulaires et moléculaires

Les ARN cellulaires contiennent de nombreux nucléotides modifiés post-transcriptionnellement. Ces nucléotides sont maintenant connus pour jouer un rôle important dans la régulation de l'expression des gènes. Ces résidus inhabituels sont trouvés dans tous les organismes et dans tous les types d'ARN, y compris les ARN messagers humains. Cependant, leurs positions dans les ARN et aussi leurs fonctions exactes, ainsi que leurs liens avec les pathologies restent largement inconnus à ce jour. Notre projet vise dans un premier temps à développer des outils et des techniques pour l'analyse de ces modifications dans les ARN abondants et aussi à l’échelle du transcriptome. Dans un deuxième temps ces approches à haut débit seront appliquées pour étudier les modifications des ARN dans différentes pathologies humaines.

Pour coupler l'identification et la localisation des nucléotides modifiés avec les techniques de séquençage de l'ADN, nous employons des réactifs chimiques existants et aussi nouvellement développés pour avoir une réactivité spécifique vis-à-vis de ces nucléotides. Ces molécules chimiques sont capables de former des adduits encombrants, qui empêchent la progression d’élongation d'amorce par la transcriptas inverse (RT). Ces arrêt de RT sont détectables en utilisant des kits enzymatiques adaptés pour la conversion de ces ADNc en produits PCR ADN double brin. Après l’étape d'ajout des amorces de séquençage et de codes-barres d'identification, ces produits sont séquençés en utilisant une machine de type Illumina. Cette étape est suivie par un traitement bioinformatique pour aligner des lectures à la séquence de référence et extraire une signature spécifique correspondant à l’arrêt de la RT et à la mis-incorporation caractéristique des nucléotides à cette position. L'ensemble de ces paramètres permettent de conclure sur la présence ou l'absence de modification, ainsi que sur sa proportion relative.

Depuis le démarrage du projet en 2014, nous avons mis en place la procédure de préparation des échantillons de séquençage, permettant de déterminer avec précision l’arrêt de la RT ainsi que le taux de misincorporation position par position. Cette approche a été d'abord appliquée à la recherche du nucléotide modifié m1A qui génère naturellement une signature de RT spécifique. Celà nous a permis de rechercher ce nucléotide dans les ARNt de différents organismes et d'établir leur présence chez le Trypanosome.
Pour élargir la panoplie de modifications détectables par le séquençage, nous avons mis en place un protocole expérimental pour la détection des nucléotides 2'-O-méthylés. Cette technique est basée sur une résistance des liaisons phosphodiesteres dans l'ARN à la fragmentation, si le nucléotide voisinant est méthylé sur son 2'-OH. Cette technique est utilisée actuellement au laboratoire pour voir les variations de 2'-O-méthylations dans des situations pathologiques.
Le développement des techniques couplant la chimie et le séquençage est en cours pour d'autres modification des nucléotides, notamment m7G et m3C.

Le développement des applications nécessitant la détection et la localisation précise des modification des ARN est en plein essor. Pour il'nstant, parmi plus de 150 différentes modifications répertoriées, seulement 5 ou 6 sont détectables à grande échelle et de façon globale. Ces techniques sont pour instant limitées aux modifications ubiquitaires et présentes dans beaucoup d'organismes. D'un autre côté, le développement des techniques de détection est limitée par les traitements spécifiques connus pour ces nucléotides. Comme perspectives de ce projet, on peut mentionner d'un côté, la future extension de ces techniques à plus en plus de modifications des ARN, et de l'autre côté, l'application de ces technologies modernes aux études de différentes pathologies et dysfonctionnements métaboliques humains.

Bourgeois, G., Ney, M., Gaspar, I., Aigueperse, C., Schaefer, M., Kellner, S., Helm, M., and Motorin, Y. (2015). Eukaryotic rRNA Modification by Yeast 5-Methylcytosine-Methyltransferases and Human Proliferation-Associated Antigen p120. PloS One 10, e0133321.
Hauenschild, R., Tserovski, L., Schmid, K., Thüring, K., Winz, M.-L., Sharma, S., Entian, K.-D., Wacheul, L., Lafontaine, D.L.J., Anderson, J., et al. (2015). The reverse transcription signature of N-1-methyladenosine in RNA-Seq is sequence dependent. Nucleic Acids Res. 43, 9950–9964.
Tserovski, L., Marchand, V., Hauenschild, R., Blanloeil-Oillo, F., Helm, M., and Motorin, Y. (2016). High-throughput sequencing for 1-methyladenosine (m1A) mapping in RNA. Methods (Elsevier) in press.

Les ARN cellulaires matures contiennent de nombreux nucléotides modifiés qui sont tous formés de manière post-transcriptionnelle, par l’action spécifique d’enzymes de modifications. Notre connaissance actuelle sur les modifications des ARN est limitée aux ARN stables et abondants tels que les ARNt, ARNr et snRNA, très peu d’informations sont disponibles sur la présence et la localisation précise de ces modifications au sein d’autres ARN cellulaires comme les snoRNAs, les petits ARN régulateurs et les ARNm.
Les développements récents ont apporté une dimension nouvelle dans la compréhension des rôles et des fonctions cellulaires des nucléotides modifiés des ARN en impliquant un caractère épigénétique des modifications. Ces développements remettent en question le concept de modification covalente stable, durable et constante durant toute la vie des molécules d’ARN. Au contraire, de fortes indications renforcent l’idée que les modifications des ARN seraient transitoires et régulées, potentiellement d’importance égale à l’épissage alternatif ou à l’édition A en I. Des publications récentes de très haut niveau ont clairement mis en évidence la présence de modifications dynamiques et hautement régulées qui sont utilisées entre autre pour l’adaptation à certaines conditions de croissance. Ce phénomène a été reporté pas seulement pour les ARNm, mais également pour les ARNt, dont les modifications ont toujours été considérées comme définitives, et une extension de ce concept aux ARN régulateurs est facilement concevable. Malgré l’importance primordiale de ces modifications dans la régulation du métabolisme cellulaire, leur présence et leur localisation précise dans différents ARN cellulaires n'est pas connus. Cependant, des progrès technologiques dans le domaine, bien que limités à certaines modifications d’ARN, ont été possibles grâce à l’utilisation du séquençage à haut-débit ou à la spectrométrie de masse.
Les limitations existantes sont : (i) l’élucidation de la structure chimique précise des nucléotides modifiés dans un ARN donné et (ii) la cartographie précise de leur position exacte. Actuellement, l’analyse de molécules d’ARN individuelles est difficile et laborieuse, et est limitée par des quantités importantes de matériel de départ pour une analyse complète.
Afin de combler ces lacunes, nous proposons de développer des technologies innovantes permettant l’analyse des modifications des ARN utilisant la combinaison des technologies à haut-débit et la spectrométrie de masse.
Comme stratégie principale, nous allons combiner les 2 principes actuellement utilisés pour la détection des modifications à haut débit, à savoir la transformation chimique sélective et l’arrêt de l’élongation d’amorce par la transcriptase inverse. Des préparations d’ARN dont le profil de modification est connu seront traitées avec de nombreux agents chimiques décrits ou proposés comme réagissant spécifiquement avec les nucléotides modifiés pour altérer le comportement de la transcriptase inverse.
Ce comportement modifié sera utilisé pour définir une signature de la transcriptase inverse détectable par une analyse à haut débit sur le transcriptome entier pour identifier les sites potentiels au sein des ARN candidats. Pour la validation, les espèces ARN renfermant ces sites putatifs seront isolés par une technologie assistée par un robot en quantité suffisante pour l’analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem. Cette dernière sera ensuite appliquée pour prouver sans ambiguïté l’existence et la présence des modifications aux sites prédits.
L’objectif majeur de ce projet est de développer des outils modernes et efficaces pour l’analyse des modifications des ARN à l’échelle du transcriptome entier, avec des applications pour analyser le changement du profil des modifications des ARN dans le développement normal et pathologique.

Coordination du projet

Yuri MOTORIN (Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire (IMoPA) UMR 7365)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Johannes Gutenberg-Universität Mainz Institute of Pharmacy and Biochemistry
CNRS-UL Ingénierie Moléculaire et Physiopathologie Articulaire (IMoPA) UMR 7365

Aide de l'ANR 270 000 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2013 - 36 Mois

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