Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SVSE 3 - Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SVSE 3 - Microbiologie, immunologie, infectiologie

Médiateurs solubles du système immunitaire contre Aspergillus fumigatus – COMASPIN

COMASPIN: MEDIATEURS SOLUBLES DE SYSTEME IMMUNITAIRE CONTRE ASPERGILLUS FUMIGATUS

Aspergillus fumigatus est le pathogène fongique humain le plus répandu. Le système immunitaire inné de l'hôte est la première ligne de défense contre les infections aspergillaires. Le rôle joué par les médiateurs solubles du système immunitaire inné (système du complément, collectines et peptides antimicrobiens) reste très peu connu. L'objectif principal de notre projet est de décrypter la fonction de ces médiateurs solubles dans la défense contre A. fumigatus.

Interaction entre A. fumigatus et l'hôte médiateurs solubles du système immunitaire inné

1. Compréhension du rôle des morphotypes et des composés pariétaux de A. fumigatus lors l’activation des médiateurs solubles du système immunitaire. Les cellules fongiques sont entourées par une épaisse paroi cellulaire qui est principalement composée de polysaccharides, pigments et protéines. Cette paroi, étant localisée à la surface cellulaire, est la première structure fongique qui intéragit avec le système immunitaire de l’hôte. La composition de la paroi fongique varie avec le développement morphologique du champignon. Ainsi, le rôle des différents morphotypes cellulaires et leurs composés pariétaux lors de l’activation du complément et lors de l’interaction avec les collectines et peptides antimicrobiens sera étudié. <br /> <br />2. Analyse du rôle des protéines sécrétées par A. fumigatus sur l’activation du complément et l’induction de collectines et peptides antimicrobiens. Les protéines fongiques sécrétées sont aussi impliquées dans les mécanismes de défense fongique, d’invasion de l’hôte et l’activation du système immunitaire. Une étude récente a permis d’identifier 64 protéines qui sont libérées par A. fumigatus dans le milieu de culture. Parmi ces protéines, la protéase alcaline, Alp1, est capable d’inactiver des composants du complément. L’étude du rôle des autres protéines sécrétées sur l’activation du complément et des récepteurs est un autre volet du projet. <br /> <br />3. Etude des effets antifongiques des peptides produits par l’hôte, seuls ou en association avec d’autres drogues. Pour être actives, les drogues antimicrobiennes doivent passer la paroi fongique qui est une barrière de protection. Ainsi, la modification de la perméabilité pariétale associée à l’action de drogues ou à la délétion de gènes impliqués dans la synthèse de la paroi permettra de mieux comprendre l’activité antifongique de ces peptides antimicrobiens.

Plusieurs de ces protéines sécrétées par A. fumigatus sont disponibles au laboratoire sous forme recombinante en utilisant les systèmes d’expression Pichia pastoris ou Escherichia coli. Les protéines d’intérêt ont été testées pour étudier leur capacité d’activation ou de dégradation du complément. Les protéines présentant les meilleurs effets ont été ensuite ajoutées pendant l’opsonisation des conidies de A. fumigatus en présence de sérum humain afin de visualizer l’effet sur la phagocytose des conidies par des macrophages dérivés de monocytes humains.

La capacité des différents morphotypes de A. fumigatus à se lier au composant majoritaire du complément, C3b qui est un médiateur soluble du système immunitaire, a été analysée par FACS et par approche chimique. Les composés de la surface de la conidie fixés au C3b ont été obtenus après opsonisation en présence de sérum humain et libération par méthode chimique, puis analysés.

La capacité de SP-D, une collectine qui est un autre composant du système immunitaire, à se lier à la surface des conidies ou aux différents composés pariétaux de A. fumigatus a été mesurée par une méthode ELISA. Ensuite, l’utilisation de formes tronquées de SP-D a permis d’étudier les domaines intervenant dans les interactions avec leurs ligands.

Nous avons commencé avec le deuxième objectif proposé, le rôle des protéines sécrétées dans l’interaction avec le complément, mais aussi avec la recherche d’interaction entre C3b ou SP-D avec les différents morphotypes et/ou composés pariétaux de A. fumigatus.

1. outre la protéine Alp1, nous avons montré que la métalloprotéase Mep1 produite par A. fumigatus est capable de dégrader les composants du complément.

2. Contrairemnt à Alp1 qui est produite tardivement (après 15 heures de culture), Mep1 est présente dans la paroi de la conidie. La conidie étant le morphotype inhalé par les patients, Mep1 peut dégrader le collagène pulmonaire.

3. En présence de Mep1, l’opsonisation des conidies et leur phagocytose par les macrophages humains sont moins efficaces.

4. La collectine SP-D contient des domaines de reconnaissance du collagène et de carbohydrates. Nous avons montré que le domaine de fixation du collagène se lie également à la mélanine, pigment qui recouvre les conidies. Le domaine de reconnaissance de carbohydrates se lie au galactosaminogalactane qui est un polysaccharide produit par le mycelium de A. fumigatus.

5. le composant C3 du complément se fixe aux conidies par des liaisons covalentes de type ester.

6. Le composant C3 se fixe également à la protéine RodA de la surface des conidies.

Ce projet nous a conduit à collaborer avec Frank Veerdonk et Katharina Becker (Radboud University Medical Center, Nijmegen, The Netherlands). Nous avons observé des activités pro- et anti-inflammatoires de la chitine pariétale de A. fumigatus différentielles en function de la présence ou absence d’immunoglobulines qui sont des médiateurs solubles du système immunitaire inné. Ces résultats ont permis de rédiger un manuscrit qui est prêt à être soumis à un journal international. Nous avons également commencé une collaboration le Dr Uday Kishor (Brunel University, UK) qui possède une collection des différentes formes tronquées et/ou mutées des collectines SP-A et SP-D.

L’opsonisation des conidies de A. fumigatus est une étape importante pour leur phagocytose par les cellules phagocytaires de l’hôte. Toutefois, les mécanismes d’opsonisation et les composés de la surface des cellules fongiques impliquées ne sont pas connus. Nous avons montré la formation de complexes covalents entre la protéine RodA de la surface des conidies et le composant C3b du complément. Bien que RodA soit connue pour former une couche externe hydrophobe qui permet à la conidie d’échapper à la reconnaissance du système immunitaire de l’hôte, elle devient modifiée par le complément et favorise la phagocytose. Nous recherchons maintenant les acides aminés impliqués dans la liaison RodA-C3b.

Par ailleurs, le secrétome de A. fumigatus joue un role important pour échapper aux défenses de l’hôte. Nous avons identifié que la protéase sécrétée Mep1 est un facteur de dégradation du complément, comme la protéase alkaline Alb1. Toutefois, Alb1 est sécrétée par le mycelium et Mep1 est présente dans la paroi de la conidie. Ces données montrent que les protéases sécrétées sont des facteurs de virulence et peuvent être envisagées comme cible antifongique.

Les collectines, qui sont aussi des médiateurs solubles du système immunitaire inné, sont supposés intervenir dans l’élimination les agents infectieux. Cependant, les mécanismes d’actions restent mal connus. Nous avons montré que la collectine SP-D est capable de se fixer à des composés pariétaux de A. fumigatus. Maintenant, nous allons étudier l'importance de cette interaction dans la défense contre A. fumigatus.

1. Un manuscrit intitulé: ‘The role of Mep1, an A. fumigatus secreted metalloprotease, on the complement system’ est en cours de rédaction. Il est basé sur les résultats obtenus dans le cadre du projet COMASPIN.

2. Le projet actuel nous perme

Aspergillus fumigatus représente le pathogène fongique aérien de l’homme le plus répandu et le plus dangereux dans le monde. Il est responsable de nombreuses maladies comme l’aspergillome pulmonaire ou sinusale ou encore l’aspergillose broncho-pulmonaire allergique chez les personnes immunocompétentes. Mais surtout, l’aspergillose invasive est l’infection fongique la plus sévère, souvent fatale chez les patients immunodéprimés, principalement liés à certains cancers et transfert de greffe (greffe de moelle osseuse et d’organes solides). La mortalité élevée est due à l’absence de diagnostic précoce et à la faible efficacité des traitements antifongiques. De plus ces traitements sont extrêmement onéreux et représentent des dépenses colossales pour les différents systèmes de santé: le traitement d’un patient coute environ 80000 €, notamment en Inde où A. fumigatus est actuellement devenu la première cause d’infection fongique.

Au niveau des alvéoles pulmonaires, l’élimination des pathogènes est effectuée par le système de défense immunitaire innée : les barrières cellulaires et les médiateurs solubles. Les macrophages alvéolaires, les neutrophiles et les cellules épithéliales constituent la première ligne de défense contre A. fumigatus. Les médiateurs solubles, incluant le système du complément, des collectines et les peptides anti-microbiens ont également un rôle essentiel dans la lutte contre les microorganismes infectieux. Toutefois, leurs modes d’action vis-à-vis de A. fumigatus restent inconnues.

Les objectifs de notre projets sont d’étudier 1) les modes d’action des différents médiateurs solubles sur A. fumigatus, et 2) les mécanismes mis en place par A. fumigatus pour contourner des médiateurs solubles. En particulier, nous avons déjà montré que des protéines de surface ou secrétées sont capables de protéger A. fumigatus vis-à-vis du système immunitaire inné. Ce projet permettra de mieux comprendre les interactions hôte-A. fumigatus au niveau du poumon et le rôle clé de ces médiateurs solubles dans l’élimination des pathogènes fongiques, essentiels à l’amélioration des traitements antifongiques.

Ces objectifs sont innovants et importants pour la mycologie médicale, et combinent les trois thèmes du programme Blanc SVSE3: la microbiologie, l’immunologie, et l’infection. Cette collaboration France/Inde repose sur un objectif commun: la lutte contre les infections fongiques. Les différents partenaires ont initié cette collaboration au cours du Symposium Franco-Indien [HOPE IN RED] sponsorisé par la CEFIPRA (Inde, 2010) afin de mettre en commun nos compétences complémentaires en biologie fongique (Unité des Aspergillus, Institut Pasteur, Paris, dirigé par le Prof. Jean-Paul Latgé) et en immunité innée chez l’homme [Partenaires 2 et 3, Dr Arvind Sahu (NCCS, Pune, Inde) et Dr Taruna Madan (NIRRH, Mumbai, Inde)].

Coordinateur du projet

Monsieur Vishukumar Aimanianda (Aspergillus Unit) – vkumar@pasteur.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

NIRRH National Institute for Research In Reproductive Health, Mumbai, India
IP Aspergillus Unit
NCCS National Centre for Cell Science, Pune, India

Aide de l'ANR 270 000 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2013 - 36 Mois

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