Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SIMI 10 - Blanc – Accords bilatéraux 2013 - SIMI 10 - Nanosciences

Système nanofluidique biofonctionnalisé avec pré-concentrateur moléculaire pour la détection ultra-rapide et l’analyse cinétique – DEPSLIT

DEPSLIT

Système nanofluidique biofonctionnalisé avec pré-concentrateur moléculaire pour la détection ultra-rapide et l’analyse cinétique

Enjeux et objectifs

The proposed research project aims at developing novel biosensing platforms based on molecular confinement and electrokinetic effects within nanofluidic channels for real-time, ultrasensitive, spatially resolved and potentially multiplexed detection of biological markers. The detailed objectives of this project are to: <br />- Develop fabrication processes and adequate surface functionalization strategies allowing multiplexed molecular grafting for the realization of working nanoslit devices. <br />- Use theoretical and simulation tools to model our nanofluidic device for design optimization and extraction of reaction kinetic parameters from the sensor output so as to validate the proposed approach of using biofunctionalized nanoslits as affinity-based biosensors. <br />- Characterize and improve the performances of the nanoslit biosensor in terms of sensitivity, minimum threshold and response time, using electrokinetic effects for enhanced mass transport and sample pre-concentration. <br />- Confirm the possibility to study reaction kinetics with high spatiotemporal resolution (single-pixel resolved and real-time) using well-known biological models and compare fluorescence-based nanoslit affinity-based biosensing with commercial standard technologies (QCM and SPR). <br />- Evaluate and optimize the performances of fluorescence-based nanoslit biosensors for a relevant clinical application, e.g. the ultra-rapid detection of highly diluted biological markers in serum.

To reach our objectives, the workload is divided into 4 work packages.
WP 1: The first objective of the project is the fabrication of biofunctionalized nanoslits. The sensor will consist of probe molecules patterned within the nanoslit and target detection is then to be carried out by fluorescence measurement of bound fluorescent targets. We will specially address two general problems encountered in microfluidic-based biosensing in the specific case of our nanofluidic approach. How do we properly block the non-reactive surfaces of the nanochannels to avoid non-specific adsorption and target depletion? How do we immobilize different probes on the same chip for multiplexed detection?
WP 2: This work package targets the affinity-based biosensing application where modeling tools are required to extract binding constants from experimental sigmoids. This task will be addressed by modeling the nanoslit with FEM, and then by developing a simplified simulation tool, taking into account our specific non-diffusion limited regime, in order to efficiently carry out parametric fitting of the experimental data and extraction of kinetic constants.
WP 3: We will study the efficiency of electrokinetically driven flow and the effect of the molecular enrichment scheme by molecular damming effect of eDEP with nanoconstrictions on the enhancement of mass transport.
WP 4: The last work package intends to demonstrate the interest of nanoslit biosensors with implemented target enrichment scheme for (1) kinetic studies and (2) ultra-high sensitivity detection of relevant biomarkers. For this purpose, we will benchmark our biosensor by directly comparing it to other affinity-based biosensors (i.e. SPR and QCM) and indirectly to state-of-the-art ultra-high sensitive biosensors.

Results obtained within each WP:
WP 1:
- The consortium has successfully implemented the fabrication process of the biofunctionalized nanoslits in the LAAS cleanroom where the biosensor consists of a funtionalized gold layer embedded in a silicon nanochannel and chip encapsulation is carried out by means of a hard-PDMS covered cover slip.
- The grafting protocol for sensor functionalization was developed along with an adequate surface passivation strategy used to block the non-reactive surfaces of the nanochannels.
- An alternative bonding protocol using epoxy-silane modification of glass surfaces was proposed in order to allow the immobilization of proteins directly deposited in the nanoslit by means of a commercial spotter.
WP 2:
- A Finite Element Model of the nanoslit platform allowing the extraction of binding constants from experimental sigmoids was developed.
- A simplified one-dimensional model, taking into account our specific non-diffusion limited regime, was also implemented.
WP 3:
- Electrokinetic driven flow was used in nanochannel biosensor in order to improve the mass transport.
WP 4:
- Two representative protein-receptor pairs of different affinities, streptavidin-biotin (high affinity) and mouse IgG/anti-mouse IgG (medium affinity), were selected to demonstrate the capability of our devices to determine kinetic parameters.
- Kinetic experiments were conducted in biofunctionalized nanoslits using the selected biological models.
- Kinetic measurements were conducted using SPR on the IgG/anti-IgG pair.
- We have observed a good correlation between extracted association/dissociation constants and on/off rates measured with SPR and values reported in the literature, thus demonstrating the ability of the nanoslit biosensor proposed in this project for kinetic constant determination.

- Demonstration of the use of our nanoslit biosensor for kinetic studies: the extracted association and dissociation constants of two relevant binding pairs are in accordance with literature data and with SPR derived values
- Development of a nanoslit-embedded multiplexed immunosensor

1. T. Leïchlé, and C.-F. Chou, «Biofunctionalized nanoslits for wash-free and spatially resolved real-time sensing with full target capture«, Biomicrofluidics, 9, 034103 (2015)
2. P. Teerapanich, M. Pugniere, Y. L. Lin, C. F.Chou, and T. Leichle, «Biofunctionalized nanoslits for fluorescence monitoring of protein binding kinetics«, XII Conference on Optical Chemical Sensors and Biosensors (Europtrode 2014), Athens, Greece, April 13-16, 2014
3. P. Teerapanich, M. Pugniere, Y. L. Lin, C. F.Chou, and T. Leichle, «Determination of protein binding kinetics using a simple slit-like nanofluidic biosensor«, Biosensors 2014, Melbourne, Australia, May 27-30, 2014

Il est largement admis que le diagnostic précoce et le dépistage de nombreuses maladies comme le cancer, la pandémie de grippe ou l’infarctus du myocarde peuvent augmenter considérablement la réussite d’un traitement et améliorer la qualité de vie du patient. En 2005, la 58e Assemblée mondiale de la Santé a approuvé une résolution invitant ses Etats membres à prioriser leurs programmes de recherche sur la détection précoce du cancer. Toutefois, des obstacles importants existent pour réaliser le dépistage efficace d'une maladie. L'un des défis majeurs est la difficulté de détection à faible concentration de biomarqueurs à un stade précoce de la maladie. Les méthodes traditionnelles de détections physiques sont limitées par le faible niveau des signaux mesurés, tandis que les méthodes de détections chimiques sont limitées par les faibles cinétiques de réaction. Pour surmonter cet obstacle, de nouvelles technologies doivent être développées et mises en œuvre pour isoler et détecter les marqueurs spécifiques. Les membres du Consortium qui présentent ce projet sont pionniers dans les travaux de recherche suivants: (1) la réalisation de nanocanaux fluidiques pré-fonctionnalisés pour la détection biologique en temps réel avec la possibilité d’effectuer des études cinétiques à haute-résolution spatiale, (2) le développement de techniques de fonctionnalisation de surface pour le greffage de protéines avec un contrôle de leur orientation, et (3) la pré-concentration ultra-rapide de protéines (d’un facteur 105 en 20s, ce qui constitue l’état de l’art) à l’aide d’effets électrocinétiques dans des canaux fluidiques. En intégrant ces méthodes, nous visons à développer un nouveau système nanofluidique pour la détection en temps-réel, ultra-rapide, spatialement résolue et multiplexée de biomarqueurs, en particuliers cancéreux. L'équipe multidisciplinaire réunie ici offre des expertises en biophysique, micro/nanofluidique, micro/nanofabrication, en chimie des protéines, en fonctionnalisation de surface, et en techniques de résonance plasmonique de surface (SPR), qui sont mises en commun pour relever le défi proposé, et ce pour le cas particulier de deux biomarqueurs: un marqueur du cancer de la prostate (l’antigène spécifique de la prostate, PSA) et un marqueur cardiaque pour l’infection du myocarde, la Toponin I. Le résultat de cette étude devrait offrir une solution pratique et peu coûteuse pour le secteur et l’industrie de la santé dont bénéficierait ainsi la société en général.

Coordinateur du projet

Monsieur Thierry Leichle (Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes - CNRS)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

NTHU Department of Chemistry, National Tsing Hua University
INSERM Institut de Recherche en Cancerologie de Montpellier - INSERM
Academia Sinica Institute of Physics, Academia Sinica
LAAS Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes - CNRS

Aide de l'ANR 219 960 euros
Début et durée du projet scientifique : mars 2014 - 36 Mois

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