Blanc SVSE 8 - Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

Etudes de biologie structurale, moléculaire et cellulaire des interactions du complexe holo-TFIID humain – DiscoverIID

Mécanisme et assemblage cellulaire du Facteur de Transcription Générale TFIID

La structure ainsi que la fonction de TFIID ne sont aujourd'hui toujours pas résolus. Nous utilisons une approche multi-disciplinaire qui combine des techniques structurales, biochimiques et cellulaires afin de faire la lumière sur les mécanismes de cet important régulateur transcriptionel.

La structure, la fonction et l'assemblage cellulaire du complexe humain TFIID

«TFIID est un acteur central de la transcription des gènes de classe II, et un composé clé du complexe de pré-initiation. <br />Nous avons pour but d'accroire de façon décisive notre connaissance sur l'organisation supra-moléculaire du complexe humain TFIID, son assemblage cellulaire, ses intéractions avec le promoteur ADN et les nucléosomes à l'inteface vitale entre la chromatine et la transcription activée en appliquant une collection de techniques biochimiques, biophysiques, et de biologie cellulaire in-vivo. Nous travaillons exclusivement sur le complexe humain TFIID, produit de façon recombinante, ainsi que sur ses sous-complexes qui apparaissent dans la cellules et qui ont donc un sens physiologique. De plus, nous analysons l'assemblage du complexe holo-TFIID in-vitro et in-vivo. Nous investiguons également l'assemblage potentiel de facteurs qui assistent la formation du complexe holo-TFIID dans la cellules, et nous examinons minutieusement leur activités. <br />«

Nous avons produit les complexes TFIID, ce qui nous a permis de disséquer leurs structures et leurs fonctions grâce à l'apport de méthodes biochimiques et structurelles de pointe.
Nous déchiffrons les éléments déterminants du complexe holo-TFIID, attaché à une gamme de ligants. Nous avons préparé, en plus de l'holo-complexe de 1,6MDa, une gamme de sous-complexes qui représentent une possible voie d'assemblage, et analysé l'assemblage de l'holo-TFIID in-vitro et in-vivo. Lors d'une approche complémentaire, nous avons identifié des assemblages intermédiaires de TFIID, stables, directement dans les cellules. Nous étudions les facteurs potentiels d'assemblage qui aident à la formation du l'holo-complexe TFIID ainsi que leurs activités. De plus, nous analysons la fonction physiologique de l'assemblage du complexes TFIID et de ces intermédiaires, grâce à une variétés de moyens, afin de découvrir les programmes de transcription spécifiques qui pourraient être catalysés par ces assemblages.

Nous avons produit le complexe TFIID ainsi que ces sous-complexes intermédiaires, plaçant ainsi les bases pour disséquer le mécanisme fonctionnel de ce régulateur éssentiel de la transcription génétique. Nous avons déterminé des structures par la cristallographie , combinée à la cryo-microscopie électronique. Nous avons identifié des sous-complexes stables de TFIID, localisés à différents compartiments cellulaires, , amenant des questions interressantes comme comment la cellule regroupe ces sous-modules ensemble pour donner naissance à un holo-TFIID fonctionnel.

La répartition des sous-unités régulées est un concept emergant de la biologie cellulaire. Nos résultats donnent une preuve expérimentale du concept d'assemblage du complexe holo-TFIID à commencer par des sous-modules, qui devraient avoir leur propre fonction. Ces derniers résident dans le cytoplasme et le noyau, et les procédés de transport nucléaire devrait contrôler leur assemblages. D'autres complexes de transcription, comme SAGA, semblent prendre des voies d'assemblages similaires.

Nous avons déjà communiqué nos excitants résultats dans des publications, par ailleurs sur la découverte d'un nouveau sous-module cytoplasmique (Nature Communications, 2015). Par ailleurs, d'autres structures de microscopie électronique ou cristallopgrap

Ce projet vise à comprendre les mécanismes fondamentaux de la régulation de l’expression génique humaine lors de l’initiation de la transcription. Des biologistes moléculaires, structuraux et cellulaires vont unir leurs efforts pour explorer cette activité centrale. Cette activité est régulée par une pléthore de facteurs protéiques et notamment par de grands complexes supramoléculaires. Le premier facteur de transcription à se lier aux promoteurs des gènes à transcrire est TFIID ; un complexe d’un poids moléculaire supérieur au MDa comportant la protéine se liant à la boite TATA (TBP) et 13 sous-unités associées (TAF).
Malgré son rôle crucial, l’architecture moléculaire et le mécanisme d’assemblage de TFIID restent énigmatiques. Ceci est en partie lié à la faible abondance et à l’hétérogénéité de TFIID extrait des cellules humaines. Par voie de conséquence, l’analyse structurale de TFIID humain est limitée à environ 35 Å en dépit d’efforts majeurs des meilleurs laboratoires.
Au site d’initiation de la transcription, TFIID interagit avec des nucleosomes spécifiquement modifiés portant des marques épigénétiques sous la forme de modifications post-traductionnelles des histones. Ces marques sont le sujet d’intenses recherches, motivées par leur influence déterminante sur la fonction de la chromatine et leur impact sur plusieurs maladies humaines notamment le cancer. TFIID contient des domaines de reconnaissance de ces marques mais le mécanisme exact de liaison de TFIID à la chromatine n’est pas connu.
Pour stimuler l’expression génique, de petites protéines activatrices se lient en amont des promoteurs et communiquent avec TFIID. Pour l’heure, seules des informations structurales à faible résolution sont disponibles pour expliquer ces interactions. La nature des TAFs impliqués dans ces interactions reste méconnue à cause des incertitudes sur l’architecture de TFIID et la faible quantité de matériel disponible pour les analyses fonctionnelles.
Le mode d’assemblage de TFIID reste inconnu. Des études récentes suggèrent que TFIID est composé de modules stables pouvant représenter des intermédiaires d’assemblage auxquels ont été associés à des rôles transcriptionnels singuliers. L’identification de ces intermédiaires et d’éventuels facteurs d’assemblage reste un défi à relever.
Nous avons réussi à produire, pour la première fois, le facteur TFIID et ses sous-complexes, sous forme recombinante dans des quantités et avec une qualité suffisantes pour des études structurales et fonctionnelles. Nous avons développé à cet effet de nouvelles méthodes d’expression dans des cellules d’insectes. Dans ce projet nous exploiterons cette avancée majeure pour déterminer l’architecture de TFIID par des méthodes hybrides associant la production sous forme recombinante de TFIID et de ses sous-complexes, la cryo microscopie électronique, la cristallographie par les rayons X, la spectrométrie de masse et la modélisation. Nous étudierons également la structure de TFIID lié à des nucleosomes modifiés ainsi qu’à des activateurs et un répresseur transcriptionnels.
Nous purifierons les intermédiaires d’assemblage stables de TFIID à partir de cellules humaines afin d’analyser leur composition par spectrométrie de masse. Nous produirons ensuite ces intermédiaires de manière recombinante afin d’en analyser la structure et d’en étudier le rôle transcriptionnel par différentes méthodes incluant la transduction des protéines dans des cellules. Nous isolerons également les facteurs d’assemblage s’ils existent, afin d’étudier leur rôle dans la formation de TFIID.
Nos résultats apporteront des informations fondamentales sur la structure et la fonction de TFIID en relation avec ses interfaces cruciales avec la chromatine et la machinerie transcriptionnelle. La description de ces architectures supramoléculaires contribuera à développer les applications thérapeutiques du futur pour combattre les affections résultant d’une dérégulation de l’expression des gènes.

Coordinateur du projet

Monsieur Imre BERGER (European Molecular Biology Laboratory) – iberger@embl.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IGBMC Institut de génétique et de biologie moleculaire et cellulaire
IGBMC Institut de génétique et de biologie moleculaire et cellulaire
EMBL European Molecular Biology Laboratory

Aide de l'ANR 249 992 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2013 - 30 Mois

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