Blanc SVSE 8 - Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

stabilité génétique en quiescence – quiescenceDNA

Stabilité génétique en quiescence

Comment le matériel génétique est maintenu en quiescence n'est pas compris. Nous voulons identifier le nombre et le type de mutations qui s'accumule en fonction du temps et étudier le devenir des cellules avec des télomères courts en quiescence.

Sélection naturelle des qualités de survie en quiescence

La vie est maintenue en alternance entre croissance et quiescence. Au cours de la croissance les mutations spontanées sont exprimées en fonction du nombre de génération, alors qu'en quiescence elles seront simplement exprimées en fonction du temps. Nous voulons déterminer la fréquence et le spectre de mutations et le rôle joué par la taille des télomères pendant la quiescence. Nous rechercherons l'impact des mécanismes de défenses et de réparation contre les lésions spontanées de l'ADN en absence de réplication de l'ADN. <br />La taille des télomères naturellement diminue progressivement à chaque réplication. Le rôle de la télomèrase est de maintenir la taille des télomères. Les cellules somatiques ont une activité de la télomérase faible ou absente et on donc un nombre de générations qui est fixe. Ce phénomène est appelé la sénescence réplicative et pourrait constitue une sorte de compteur du nombre de générations des cellules. Nous voulons savoir si la longueur des télomères à également un impact sur la survie des cellules en quiescence.

Pour étudier la génétique en quiescence, nous avons dans un premier temps isolé une souche progénitrice sauvage, haploïde et prototrophe de levure S. pombe. Après une croissance courte nous stoppons la culture en retirant l'azote. Dans ces conditions les cellules font deux divisions puis arrêtent leur croissance et entre en quiescence. Elles sont transcriptionnellement et métaboliquement actives, consomment le glucose et respirent pour subvenir à une homéostasie des structures et des fonctions cellulaires. Les mutations spontanées peuvent être déterminées à l'aide de marqueurs génétique contre sélectionnables. Nous pouvons étaler sur boites de pétrie une quantité constante de cellules après 1, 2, 4, 8 et 16 jours et contre sélectionner les mutants ura4 et ura5 sur acide 5-fluorootic (5-FOA). Les mutants ura4 ou ura5 peuvent être séquencés. Nous pouvons aussi conserver la culture sur des temps plus long de 1 à 3 mois et faire la séquence des génomes de plusieurs individues et cette fois en absence de sélection. Ce type d'étude sera étendu à des souches mutées dans des voies de réparation de l'ADN.
Pour étudier la sénescence en quiescence nous ferons entrer en quiescence des cellules avec des télomères de plus en plus courts. Nous étudierons les télomères avec des approches cellulaires et moléculaires.

Nous avons montré une accumulation de mutants à une fréquence de 0,6 10-7 par jour de quiescence. Le séquençage a révélé que le nombre de SNP s’accumule en quiescence 6 fois moins vite que les indels, contrairement à ce qui est observé en croissance. L’extrapolation du taux de mutations permet d’estimer une mutation par génome après 2 à 3 mois de quiescence. Nous avons séquencé (paired-end et 50x de profondeur) les génomes de trente individus de trois mois et trouvé en moyenne 0,8 SNPs et 1,3 indels par génome avec des FDR respectivement de 80% et 70%. Un manuscrit a été écrit « Spontaneous mutation rates and spectrum in quiescence ». Nous terminons la partie d’analyse statistique des données. Nous avons montré que les enzymes impliquées dans la détection et l'elimination de l'uracile dans l'ADN sont important en quiescence. L'étude biochimique est en cours.
Nous avons montré que les télomères relocalisent progressivement au nucléole diamétralement opposés aux centromères en quiescence (nouvelle collaboration avec Sylvie Tournier, Toulouse). Nous analysons le rôle des protéines de l’hétérochromatine des télomères dans ce processus. Nous avons également montré que la taille des télomères est décisive pour la survie en quiescence. De plus les télomères courts sont instables et réarrangent rapidement en quiescence. Le type de réarrangement est spécifique des cellules quiescentes et n’a jamais été décrit. Ce réarrangement n’est pas stable lorsque les cellules repartent en croissance.

Les mutations entrainent des phénotypes et exposent les cellules à la sélection naturelle, responsables de nombreuses de l'adaptation et l'évolution des espèces. Ceci est bien connu pour les systèmes en croissance et n'a jamais été décrit en quiescence. La levure S. pombe étant sexuée et haploide, elle est assimilable à une cellule germinale. Une extension de nos observations à d'autres organismes nous permet de proposer l'hypothèse suivante: Nous proposons que les gamètes mâles sont responsables des performances de division cellulaire et les gamètes femelles sont responsables des performances de quiescence. Nous avons décrit un nouveau réarrangement télomèrique spécifique de quiescence qui ne semble pas compatible avec la croissance.

un manuscrit sur la quiescence est en préparation et plusieurs présentations orales à des colloques ont été faites.

Les cancers et les maladies dégénératives constituent des enjeux majeurs de santé publique dans les pays développés. De nombreuses études démontrent que les cancers sont associés à une instabilité génétique due à des défauts de détection ou de réparation des lésions de l'ADN. Des études plus récentes montrent qu'un nombre croissant de maladies neuro-dégénératives est également associé à des instabilités de notre matériel génétique. Ces résultats posent la question du fonctionnement de la réparation de l’ADN dans les cellules quiescentes comme les neurones. Ces cellules post mitotiques sont souvent métaboliquement très actives et doivent à ce titre se protéger contre différentes agressions génotoxiques intrinsèques ou extrinsèques. Alors que les mécanismes de réparation de l'ADN sont bien compris dans les cellules en division, il devient à présent essentiel de comprendre la logique des mécanismes de réparation de l’ADN dans les cellules quiescentes.

Différents travaux pionniers ont montré que la levure Schizosaccharomyces pombe constitue un très bon modèle d'étude de la quiescence. Cette levure fissipare peut être maintenue expérimentalement pendant plusieurs semaines en quiescence en absence d'azote. Les deux équipes impliquées dans ce projet, spécialisées dans la structure de la chromatine, la réparation de l’ADN et les télomères, ont publié et accumulé des résultats préliminaires importants qui ont justifié l’utilisation de la levure fissipare pour l'étude de la stabilité génétique en quiescence.

Le projet est divisé en trois grandes parties. Nous voulons dans un premier temps étudier l’importance des grandes voies de réparation de l’ADN pour la survie des cellules maintenues en quiescence. Nous établirons une hiérarchie des voies de réparation contribuant à l’intégrité du matériel génétique des cellules quiescentes, permettant la déduction les sources physiologiques de ces lésions. Dans des conditions équivalentes, nous déterminerons le taux et les spectres des mutations sur des gènes choisis. Dans un deuxième temps, nous voulons comprendre les mécanismes contribuant à l’instabilité d’une répétition particulière (GGGGCC) dont l’expansion est impliquée dans la sclérose latérale amyotrophique et les démences fronto-temporales. Finalement, nous étudierons les mécanismes qui maintiennent la stabilité des télomères en quiescence et la survie des cellules quiescentes possédant des télomères dysfonctionnels. Ces études conjointes devraient conduire à une progression notable de notre compréhension de la stabilité génétique en quiescence. Nous anticipons que les connaissances acquises au cours de projet auront un impact important dans la connaissance des maladies liées au vieillissement de la population.

Coordinateur du projet

Monsieur Benoit ARCANGIOLI (Unité de la Dynamique du génome, Institut Pasteur)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Institut Pasteur Unité de la Dynamique du génome, Institut Pasteur
CNRS DR12_CRCM Centre national de la Recherche Scientifique Délégation Provence et Corse _ Centre de recherche en cancérologie de Marseille

Aide de l'ANR 379 916 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2013 - 36 Mois

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