Blanc SVSE 8 - Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

Exploration structurale et fonctionnelle du domaine C-terminal intrinsèquement désordonné de ErbB2 – ERBB2CTER

Exploration structurale et fonctionnelle de la partie C-terminale intrinsèquement désordonnée de ErbB2

Les études de ErbB2, jusqu'à présent focalisées sur les domaines extra-cellulaire et transmembranaires, ont permis la mise au point d'un traitement efficace anti-ErbB2 contre le cancer du sein. Cependant, seules 30% des tumeurs répondent au traitement au trastuzumab, et celles qui y sont sensibles deviennent résistantes au bout de trois ans de traitement. L’implication du domaine cytoplasmique C-terminal de ErbB2 (CtErbB2) dans les processus de signalisation est avérée mais mal comprise.

Mieux comprendre les bases moléculaires de la fonction de CtErbB2, en combinant les outils de la biologie structurale et cellulaire.

Notre objectif est ici de se concentrer sur le domaine cytoplasmique C-terminal de ErbB2 (CtErbB2), dont l’implication dans les processus de signalisation est avérée mais mal comprise. L’un des enjeux relevé dans ce projet est de caractériser en détail la structure et la dynamique d’un large domaine intrinsèquement déplié, libre et lié à certains de ses partenaires. Nous analyserons plus particulièrement l’impact des prolines, qui sont sur-représentées dans la séquence, et de la phosphorylation des tyrosines, qui est directement liée à des processus de signalisation, sur la structure, la dynamique et la fonction du domaine. <br />Le projet est décomposé en cinq parties. Les tâches 1 et 2 cibleront des études structurales de complexes formés entre de petits peptides dérivés du domaine C-terminal d’ErbB2 et des modules de fixation de protéines associées à ce domaine non-structuré. Les objectifs de cette partie du projet seront i) d’identifier les spécificités de ces partenaires modulaires pour les différentes phosphotyrosines afin d’en déterminer leur importance et la nécessité d’une telle redondance, ii) de mettre en évidence l’importance des résidus proline dans les processus de reconnaissance et dans la flexibilité de ce domaine. Les tâches 3 et 4 portent sur l’analyse de l’influence de la liaison des différentes protéines à plus longue distance le long de tout le domaine C-terminal de ErbB2. Le but est de s’attaquer à l’analyse de la coopérativité et de l’affinité globale des interactions impliquant plusieurs sites ou plusieurs modules de fixation. Enfin, la tâche 5 se consacrera à une étude cellulaire de mutants du domaine C-terminal et sera conduite en parallèle et en étroite interaction avec les tâches 1 à 4. L’influence de ces mutations sur la fixation des protéines adaptatrices, sur les voies de signalisation et sur les fonctions cellulaires telles que la prolifération cellulaire ou la migration cellulaire sera alors explorée.

Une approche pluridisciplinaire combinant la biologie structurale (principalement la RMN, mais aussi le SAXS, la modélisation, et des approches biophysiques) et la biologie cellulaire sera à la base du projet.
Le succès de cette approche multidisciplinaire repose sur une forte complémentarité et une coordination efficace entre trois équipes recouvrant les domaines de la biologie cellulaire, de la biophysique et de la RMN structurale. Les responsables de ces trois équipes sont hautement qualifiés et experts dans la signalisation associée à ErbB2, la caractérisation biophysique et la structure de complexes macromoléculaires et enfin la RMN des protéines intrinsèquement désordonnées.
Les très nombreuses connaissances biologiques sur les interactions impliquant ErbB2, trouvées dans la littérature, et l’accès à des tests biologiques in vivo de prolifération et de migration cellulaires permettront d’intégrer les données structurales dans un contexte biologique bien établi.

Principaux résultats au 15 décembre 2014
• Production du domaine C-terminal entier pour des étude RMN (maquage 15N, 13C)
• Attribution quasi-complète des résonances du squelette (et Cb) de CtErbB2
• Caractérisation de l'ensemble conformationnel de CtErbB2 en cours à partir des données de relaxation, RDCs et PRE (RMN). Bien que largement désordonnée, les déplacements chimiques indiquent que la protéine n'est pas une pelote statistique.
• Premiers tests positifs de phosphorylation effectués avec la kinase de ErbB2 sur de faibles quantité (analyse par spectrométrie de masse).
• Finalisation de l'étude d'interaction entre un fragment peptidique de CtErbB2 (1146-RPQPPSPRE) et le domaine SH3 de Fyn (voir publications).

1- Analyse structurale du domaine C-ter par RDC, PRE et SAXS
2- Analyse de la dynamique du domaine C-ter (relaxation) et mutagénèse de séquences polyproline
3- Finaliser l'étude de l'interaction FynSH3/CtErbB2
4- Phosphorylation du domaine C-ter (optimisation des phosphorylations complètes et partielles de chaque tyrosine).
5- Expériences de pulldown avec le domaine entier non phosphorylé afin d’identifier des partenaires qui n’interagissent pas avec les phosphotyrosines (SrcSH3). Puis avec le domaine C-ter phosphorylé. Le tag histidine-lipoyl sera utilisé pour le pulldown.
6- Mise en place des expériences in cellulo sur les lignées cellulaires n’exprimant pas ErbB2 (T47D) et surexprimant ErbB2 (SkBr3). La délétion du domaine C-ter sera une première étape de mutagénèse. Puis sur les bases des données structurales (importance de résidus prolines dans la dynamique et les interactions) des mutants seront construits et testés afin d’identifier les voies métaboliques perturbées.
7- Les interactions C-ter ErbB2 avec Grb2 (SH2SH3 et SH3SH2SH3), Shc et MEMO seront entreprises afin d’identifier de nouveaux sites d’interaction et s’il y a compétition entre les partenaires. Ce point nécessitera la parfaite maitrise de la phosphorylation des tyrosines.
8- Ces interactions seront ensuite analysées sur des mutants polyproline ciblant la dynamique de la molécule.

Bornet O, Nouailler M, Feracci M, Sebban-Kreuzer C, Byrne D, Halimi H, Morelli X, Badache A, GuerlesquinF. Identification of a Src kinase SH3 binding site in the C-terminal domain of the human ErbB2 receptor tyrosine kinase. (2014) FEBS Lett. 588(12):2031

La surexpression du récepteur ErbB2 entraine l’activation constitutive de voies de signalisation associées à son activité tyrosine kinase. Plusieurs études ont montré qu’ErbB2 était capable d’induire plusieurs des caractéristiques des cellules cancéreuses, dont la prolifération, la résistance à l’apoptose et l’augmentation de la mobilité cellulaire. Les études précédentes se sont concentrées sur les domaines extracellulaires et transmembranaires de la protéine et ont en conduit à la mise en place d’une thérapie efficace contre le cancer du sein. Cependant, seuls 30% des tumeurs répondent au traitement au trastuzumab, et celles qui y sont sensibles deviennent résistantes au bout de trois ans de traitement. Notre objectif est ici de se concentrer sur le domaine cytoplasmique C-terminal de ErbB2 (CtErbB2), dont l’implication dans les processus de signalisation est avérée mais mal comprise. L’un des chalenges relevé dans ce projet est de caractériser en détail la structure et la dynamique d’une large domaine intrinsèquement déplié libre et lié à certains de ses partenaires. Nous analyserons plus particulièrement l’impact des prolines, qui sont sur représentées dans la séquence, sur la structure, la dynamique et la fonction du domaine. Une approche pluridisciplinaire combinant la biologie structurale (principalement la RMN, mais aussi le SAXS, la modélisation, et des approches biophysiques) et la biologie cellulaire sera à la base du projet. Les très nombreuses connaissances biologiques sur les interactions impliquant ErbB2, trouvées dans la littérature, et l’accès à des tests biologiques in vivo de prolifération et de migration cellulaires permettront d’intégrer les données structurales dans un contexte biologique bien établi.
Le succès de cette approche multidisciplinaire repose sur une forte complémentarité et une coordination efficace entre trois équipes recouvrant les domaines de la biologie cellulaire, de la biophysique et de la RMN structurale. Les responsables de ces trois équipes sont hautement qualifiés et experts dans la signalisation associée à ErbB2, la caractérisation biophysique et la structure de complexes macromoléculaires et enfin la RMN des protéines intrinsèquement désordonnées. Afin d’atteindre les objectifs fixés, le projet est décomposé en cinq parties. Les tâches 1 et 2 cibleront des études structurales de complexes formés entre de petits peptides dérivés du domaine C-terminal d’ErbB2 et des modules de fixation de protéines associées à ce domaine non-structuré. Les objectifs de cette partie du projet étant i) d’identifier les spécificités de ces partenaires modulaires pour les différentes phosphotyrosines afin d’en déterminer leur importance et la nécessité d’une telle redondance, ii) de mettre en évidence l’importance des résidus proline dans les processus de reconnaissance et dans la flexibilité de ce domaine. Les tâches 3 et 4 portent sur l’analyse de l’influence de la liaison des différentes protéines à plus longue distance le long de tout le domaine C-terminal de ErbB2. Le but est de s’attaquer à l’analyse de la coopérativité et de l’affinité globale des interactions impliquant plusieurs sites ou plusieurs modules de fixation. Enfin, la tâche 5 se consacrera à une étude cellulaire de mutants du domaine C-terminal et sera conduite en parallèle et en étroite interaction avec les tâches 1 à 4. L’influence de ces mutations sur la fixation des protéines adaptatrices, sur les voies de signalisation et sur les fonctions cellulaires telles que la prolifération cellulaire ou la migration cellulaire sera alors établie. L’ensemble de nos travaux devrait aboutir à un modèle structural intégré des complexes formés par le domaine C-terminal d’ErbB2.

Coordinateur du projet

Madame Carine VAN HEIJENOORT (Institut de Chimie des Substances Naturelles)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS DR12 -LISM Centre National de la Recherche Scientifique Délégation Provence et Corse _ Laboratoire d'Ingenierie des Systèmes Macromoléculaires
INSERM-CRCM Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille
CNRS-ICSN Institut de Chimie des Substances Naturelles

Aide de l'ANR 319 561 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2013 - 42 Mois

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