Blanc SVSE 8 - Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

Elucidation structurale et fonctionnelle du processus de réplication génomique des poxvirus – REPLIPOX

Dans le cœur d’un tueur : la machinerie de réplication des poxvirus

L’enjeu du projet est double : Etablir clairement le mécanisme de réplication des poxvirus et fournir des structures à haute résolution des partenaires de ce processus : l’holoenzyme de la polymérase et la hélicase-primase. Ce travail va permettre de comprendre la réplication de l’ADN des poxvirus qui diffère des mécanismes décrits précédemment. A long terme l’information structurale va permettre un avancement majeur dans la conception composées anti-poxvirus.

Comprendre structure et fonction de la machine de réplication de l’ADN des poxvirus dans la perspective d’un développement d’antiviraux

Le virus de la variole (famille: Poxviridae, genus: Orthopoxvirus) a été à l’origine de la variole, une des maladies les plus létales et dévastatrices qui ont jamais existées. Après une campagne intense de vaccination coordonnée par l’Organisation Mondiale de la Santé, l’éradication de la variole a été déclarée en 1979. Peu après, le programme de vaccination a été arrêté ; et aujourd’hui la grande majorité de la population et immunologiquement naïve par rapport au poxvirus. Il n’existe pas de traitement antiviral vraiment spécifique et approuvé à ce jour. Pour cette raison, le virus de la variole présente une menace considérable s’il serait utilisé à des fins militaires ou de bioterrorisme. Depuis les attaques terroristes de septembre 2001, l’Institut de Recherche Biomédicale des Armées (IRBA) a fait des efforts importants pour développer des contre-mesures par rapport aux poxvirus. Mais le risque de zoonose et d’une réintroduction d’un réservoir animal est considérable. Dans ce cadre une collaboration a été établie entre l’IRBA et le groupe « Biologie intégrative des Virus Persistants » à l’UVHCI qui s’est focalisée sur l’étude des principales protéines du complexe de réplication de l’ADN des poxvirus. A long terme ce travail facilitera la conception de médicaments ciblant la réplication de l’ADN virale.

Nous travaillons sur le virus de la vaccine, le virus utilisé pour la vaccination qui représente un modèle sûr pour les poxvirus. Nous étudions le cœur de la réplication de l’ADN qui consiste dans la polymérase E9 avec son facteur de processivité composé de A20 et de D4, une uracile-ADN glycosylase (UNG) d’un côté, et de l’hélicase-primase hexamèrique D5 de l’autre côté. Ces protéines ont une identité de plus de 95 % par rapport à leurs équivalents du virus de la variole. Nous exprimons ces 4 protéines dans le système cellules d’insectes – baculovirus pendant que des fragments de ces protéines sont exprimés en bactéries. Une combinaison de techniques biophysiques (comme la cristallographie aux rayons x, la microscopie électronique, la diffusion des rayons x aux petits angles et la diffusion de la lumière laser) sont utilisés dans une approche multi-échelles afin de progresser vers la structure haute-résolution de ces complexes. D’autres techniques, comme la résonance plasmonique de surface et l’anisotropie de fluorescence sont utilisées afin de comprendre les interactions au sein de cette machine et la fonction des composantes.

Nous avons considérablement progressé au niveau de la structure de l’holoenzyme de la polymérase et par rapport à l’organisation de l’hélicase-primase D5. Nous avons produit et purifié le complexe entre D4 et le 50 premier acides aminés d’A20 (D4/A20(1-50)). Pendant que D4 forme des homodimères en solution quand elle est exprimée seule, D4/A20(1-50) est clairement un hétérodimère. Il est intéressant de savoir que le « docking » de molécules inhibitrices ciblées contre l’interface A20/D4 reproduit plusieurs aspects de l’interaction D4/A20(1-50). Nos données ont contribuées à la compréhension de l’assemblage du facteur de processivité de la polymérase et seront utiles dans la conception d’antiviraux ciblant l’interface D4/A20. Nous avons aussi obtenu la structure de cette uracile-ADN glycosylase (UNG) D4/A20(1-50) en complexe avec un 10-mer ADN double-brin qui contient un site abasique résultant de la coupure d’une base d’uracile. La comparaison avec l’UNG humaine a révélé des différences importantes au niveau de l’interface entre enzyme et ADN et par rapport à l’orientation de l’enzyme sur l’ADN. Néanmoins, la conformation de l’ADN double-brin dans ces deux structures est très similaire. Contrairement à l’UNG humaine, D4 est rigide et ne se referme pas autour de l’ADN. Cette structure permet de mieux comprendre le rôle de D4 comme cofacteur de la polymerase du virus de la vaccine et permet de mieux comprendre les déterminants structuraux nécessaires pour une activité UNG. Nous avons obtenus des premières informations sur la structure globale et la fonction de l’hélicase-primase D5 et nous avons pu montrer que le domaine hélicase s’arrange en hexamère, arrangement qui est nécessaire pour l’activité enzymatique. Cette activité enzymatique ne dépend pas du type de nucléoside triphosphate utilisé. L’hexamère se lie fortement l’ADN double – et simple-brin. L’organisation des domaines diffère des hélicases-primases connues.

Le futur travail sera centré sur la structure de la polymérase E9 à haute résolution et sur la structure de l’interface avec A20. Cette connaissance sera une base pour la conception basée sur la structure d’antiviraux contre la variole et d’autres poxvirus. Un autre but est de faire progresser la structure de la helicase-primase D5 vers une résolution plus élevée ; une tâche qui sera aidée par l’information sur l’organisation de cette protéine que nous avons obtenues. Des travaux seront menés afin de comprendre le chargement et l’activation de l’hélicase.

Contesto-Richefeu, C., Tarbouriech, N., Brazzolotto, X., Betzi, S., Morelli, X., Burmeister, W. P., & Iseni, F. Crystal structure of the Vaccinia virus DNA polymerase holoenzyme subunit D4 in complex with the A20 N-terminus domain. PLoS Pathogens 10, e1003978 (2014).
Burmeister, W.P., Tarbouriech, N., Fender, P., Contesto-Richefeu, C., Peyrefitte, C.N., Iseni & F. Crystal structure of the vaccinia virus uracil DNA-glycosylase in complex with DNA. J Biol. Chem. pii: jbc.M115.648352. (2015).

La variole a été un fléau majeur pendant des siècles avant son éradication en 1979. Néanmoins le risque d’une utilisation bioterroriste et la réintroduction de virus apparentés à partir d’un réservoir animal persiste. Les poxvirus sont particuliers car leur réplication est cytoplasmique et repose donc entièrement sur des protéines codées par le génome viral. Leur génome est formé d’un ADN linéaire double brin circularisé aux extrémités par des structures en épingle à cheveux. Cette organisation génomique est aussi présente chez des phycodnavirus et des afsarvirus. Tous ces virus partagent le même type d’ADN polymérase et d’hélicase-primase ainsi que d’autres spécificités et ont été regroupé pour former le clade des grands virus à ADN nucléo-cytoplasmique (NCLDV). Au début des années 80, plusieurs modèles de réplication des poxvirus ont été proposés basés sur une coupure simple brin, suivie d’une élongation monodirectionnelle et d’un réarrangement de brin. Mais l’identification d’une primase et les premiers résultats sur la structure 3D du complexe de réplication obtenus récemment par nos équipes challengent ces anciens modèles. Nous avons montré que l’hélicase-primase D5 est hexamérique comme d’autres hélicases de la famille 3. Cela suggère plutôt un mécanisme impliquant une fourche de réplication. Nous proposons de développer les investigations structurales et fonctionnelles de la machinerie de réplication impliquant d’un coté l’ADN polymérase E9, l’uracile ADN glycosidase D4 et le facteur de processivité A20 et de l’autre coté l’hélicase-primase hexamérique D5. En utilisant l’expression recombinante de protéines du virus de la vaccine, qui est un modèle à 97% identique au virus de la variole, nous sommes capables de produire des milligrammes de ces 4 composants en cellules d’insecte et certaines constructions de D4 et A20 s’expriment aussi en bactérie. Nous utiliserons la cristallographie des protéines et la microscopie électronique pour continuer le travail structural que nous avons engagé récemment afin de déterminer le détail des interactions moléculaires au sein de ces complexes. La reconstitution de la machinerie de réplication in vitro est aussi à notre portée et facilitera grandement nos études fonctionnelles. Comme nous avons révélé récemment la distance importante entre les sites catalytiques du complexe de réplication, nous souhaiterions définir précisément le rôle de D4 ainsi que l’activité primase en utilisant ce modèle in vitro. L’activité hélicase de D5 doit aussi être prouvée expérimentalement et pourrait nécessiter l’identification et l’inclusion de protéines partenaires. Nous pensons qu’une percée dans la compréhension de la réplication des poxvirus est à notre portée avec des implications fortes pour les autres virus du clade NCLDV et des applications potentielles dans la modélisation d’antiviraux, en particulier de composés ciblant les surfaces d’interactions au sein du complexe.

Coordinateur du projet

Monsieur Wim Burmeister (Unit of Virus Host Cell Interactions)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UMI 3265 UJF-EMBL-CNRS Unit of Virus Host Cell Interactions
CEA/DSV/IBS Commissariat a l'energie atomique et aux energies alternatives
IRBA Institut de Recherche Biomédical des Armées

Aide de l'ANR 350 000 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2012 - 42 Mois

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