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Publication du programme PAUSE – ANR Ukraine pour l’accueil de scientifiques ukrainiens et ukrainiennes dans des laboratoires français
Blanc SVSE 8 - Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

La nucléation et l’organisation des microtubules par les complexes multiprotéiques de tubuline gamma – gTuRC

La nucléation et l’organisation des microtubules par les complexes multiprotéiques de tubuline gamma

Nous souhaitons comprendre les mécanismes d'activation de la nucléation des microtubules à partir des complexes multi-protéiques de la tubuline gamma, ainsi que l'ancrage des complexes au centrosome. Les rôles des protéines interagissant avec la tubuline gamma dans ces processus seront étudiés.

1) Activation de la nucléation par les protéines interaggisant avec le gamma-TuRC; 2) Changements confomationnelles dans les GCP; 3) Rôle cellulaire de la ninéine

1) Activation de la nucléation des microtubules par des protéines interagissant avec le gamma-TuRC : <br />a) Une variété de protéines qui sont connues pour se lier au gamma-TuRC seront testés pour leur capacité à activer la nucléation des microtubules in vitro. Les effets de ces protéines sur des changements conformationnels au sein du gamma-TuRC seront testés. Des méthodes microscopiques seront utilisées pour l'analyse de la nucléation des microtubules. <br />b) une protéine qui a été impliqué dans l'activation de la nucléation des microtubules possède une séquence consensus qui est conservé parmi de nombreuses espèces, et qui est suffisante pour l'activation. Un peptide synthétique de cette séquence sera utilisé pour étudier l'interaction possible avec des protéines individuelles du gamma-TuRC par RMN. <br /> <br />2) Les changements de conformation des protéines GCP: <br />Nous allons cloner et purifier des domaines recombinants des protéines GCP2 et GCP3 et résoudre leurs structures atomiques par cristallographie aux rayons X. Cela nous permettra de conclure sur les différences structurelles et conformationnelles importantes entre GCP 2 et 3. Ceci fournira des informations essentielles à la compréhension des mécanismes de la nucléation des microtubules, ce qui semble être activés (au moins en partie) par des changements conformationnels dans GCP3. <br /> <br />3) Le rôle cellulaire de la ninéine dans la nucléation et l'ancrage des microtubules: <br />Nous allons étudier le rôle des protéines centrosomales ninéine et d'autres dans la liaison aux gamma-TuRC, en utilisant des cellules KO de la ninéine. Ce système expérimental nous permettra d'étudier la fonction des domaines protéiques de la ninéine en l’absence de la ninéine endogène. De plus, cela nous permettra d'évaluer la contribution d'autres protéines dans la liaison des gamma-TuRCs au centrosome, en l’absence de la ninéine.

Les techniques utilisées comprennent la purification biochimique de protéines recombinantes, et l'étude de leur interaction en utilisant des méthodes biophysiques, y compris RMN, le transfert d'énergie par résonance (FRET/FLIM), diffusion dynamique de la lumière (DLS), chromatographie d'exclusion stérique / diffusion de la lumière laser à angles multiples (SEC MALLS), fluorimétrie différentielle à balayage (DSF), cristallographie aux rayons X, et microscopie à fluorescence. L'étude des protéines purifiées sera accompagnée par une analyse au niveau cellulaire, impliquant la culture cellulaire et la transfection.

Nous avons purifié des complexes de la tubuline gamma à partir d'une lignée cellulaire exprimant une tubuline gamma étiquetée. Nous avons caractérisé ces complexes dans une série d'études de réticulation pour déterminer les interactions entre les GCP spécifiques. En outre, nous avons exprimé diverses protéines de fusion recombinantes interagissant avec le gamma-TuRC. Une partie de ces protéines était très peu soluble, sauf dans des conditions dénaturantes, et inadaptées pour des études biophysiques. D'autres pourraient être purifiés sous une forme soluble dans des conditions non-dénaturantes, ce qui nous permet de poursuivre notre projet prévu. Pour étudier les interactions avec les GCP, et pour analyser les changements conformationnels dans le gamma-TuRC au cours de son activation, nous avons purifié les GCP principales, 2 et 3. Expression des GCP 2 et 3 « pleine taille » n’a pas donné de protéine fonctionnelle. Nous avons essayé la purification des domaines GRIP2 des deux protéines, car ils contiennent le site de liaison à la tubuline gamma. Nous avons été confrontés à nouveau la difficulté de mauvais rendement de protéines solubles. Une variété de températures ont été choisies pour la croissance bactérienne et à l'induction de l'expression de la protéine. De plus, des étiquettes spéciales ont été ajoutées pour augmenter le rendement en protéine recombinante soluble. Nos approches nécessitent encore l'optimisation. Autres domaines protéiques (Grip 1 et les domaines amino-terminaux extrêmes) ont été clonés dans des vecteurs d'expression, et les études d'expression ont été lancées. Pour compléter nos études biochimiques et biophysiques par une analyse au niveau cellulaire, nous avons étudié les interactions des GCP dans le gamma-TuRC au centrosome, en utilisant une analyse FRET/FLIM. En outre, nous avons étudié le rôle d'une protéine d'ancrage du gamma-TuRC au centrosome, la ninéine. Les rôles cellulaires de la ninéine sont actuellement à l'étude.

Dans la prochaine phase du projet, nous allons utiliser les outils générés jusqu'ici (les constructions plasmidiques, des protéines purifiées, lignées cellulaires) pour des études biophysiques et pour des études en biologie cellulaire. L'objectif sera de caractériser les mécanismes moléculaires de la nucléation des microtubules par les gamma-TuRCs, et de comprendre la fonction cellulaire de protéines individuelles interagissant dans le processus d'activation.

N/A

Les complexes multiprotéiques de gamma-tubuline sont essentiels à la formation du réseau de microtubules et à la dynamique des microtubules, chez tous les eucaryotes. Dans la plupart des organismes, ces complexes existent sous la forme d’anneaux ouverts appelés “gamma-Tubulin Ring Complexes” ou “gamma-TuRCs”. Les gamma-TuRCs sont majoritairement présents dans le cytoplasme sous la forme d’un pool soluble et inactif. La fraction active minoritaire est liée au centrosome et/ou à d’autres centres organisateurs des microtubules. Le potentiel de nucléation des microtubules est donc souvent corrélé à la liaison des gamma-TuRCs au centrosome. Plusieurs protéines centrosomales ont été caractérisées comme des partenaires du gamma-TuRC. Parmi elles, la protéine Cdk5rap2 a récemment été décrite comme un activateur du gamma-TuRC : son domaine N-terminal CM1 est suffisant pour l’activation. De plus, ce domaine CM1 semble activer les gamma-TuRCs indépendamment de leur localisation, et en particulier le pool soluble présent dans le cytoplasme. A partir de ces données, nous pouvons envisager des stratégies qui permettent de découpler la liaison au centrosome et l’activation du gamma-TuRC Dans ce projet, nous caractériserons les mécanismes par lesquels Cdk5rap2 peut activer le gamma-TuRC, et nous rechercherons si d’autres protéines peuvent exercer une fonction activatrice similaire. L’activation du gamma-TuRC impliquerait des changements conformationels au sein du complexe, en particulier au niveau d’un de ses constituants, GCP3. Nous étudierons la capacité des différentes sous-unités du gamma-TuRC à se lier au domaine CM1, et nous testerons si la conformation de GCP3 est altérée par la liaison à CM1. Cette analyse impliquera des méthodes biophysiques telles que la RMN ou le transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (FRET). Pour comprendre les modifications conformationelles au niveau structural, nous déterminerons la structure cristallographique de la protéine GCP3 « flexible » et de la sous-unité GCP2 plus « rigide ». Ceci se fera par cristallographie aux rayons X des différents domaines de ces protéines, et par remplacement moléculaire et modélisation, en utilisant la structure que nous avons récemment publiée de la sous-unité GCP4 du gamma-TuRC. Nous étudierons également le mécanisme de liaison des gamma-TuRCs au centrosome, en étudiant le rôle de la protéine ninéine. En utilisant des cellules dérivées d’une souris knockout pour la ninéine, nous caractériserons les différents domaines de la ninéine, précédemment décrits comme impliqués dans la nucléation et l’ancrage des microtubules, dans un fond génétique nul pour la ninéine. En outre, nous testerons la contribution d’autres protéines centrosomales pouvant interagir avec la ninéine et qui pourraient contribuer à l’activation et la liaison des gamma-TuRCs au centrosome.

Coordinateur du projet

Monsieur Andreas MERDES (Centre de Biologie du Développement) – andreas.merdes@univ-tlse3.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

Université Toulouse III Centre de Biologie du Développement
CNRS Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale
CNRS Institut de Pharmacologie et de Biologie Strucutrale

Aide de l'ANR 350 000 euros
Début et durée du projet scientifique : décembre 2013 - 42 Mois

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