Mécanismes moléculaires de la transduction de signal par BvgS, un modèle de la famille de récepteurs kinases bactériens à domaines Vénus Flytrap – MECA VENUS

La cristallographie aux rayons X est utilisée pour déterminer les structures de la portion périplasmique et du domaine PAS de BvgS. La caractérisation de la dynamique des VFT fait appel à des simulations en dynamique moléculaire et à des analyses des modes normaux de mouvement de la protéine.
Pour identifier des ligands potentiels de BvgS, des méthodes in vivo et in vitro sont utilisées. Un système de rapporteur fluorescent permet de mesurer l’activité de BvgS en réponse à des molécules ajoutées aux bactéries en culture. Des criblages rapides sont effectués par une technique qui mesure le changement de la température de dénaturation du domaine protéique purifié, en présence de molécules candidates.
Pour caractériser l’interaction entre BvgS et un ligand, la thermophorèse, la microcalorimétrie et la résonance paramagnétique électronique sont utilisées.
La mutagenèse dirigée sert à modifier de façon ciblée les domaines de perception et les hélices de signalisation de BvgS afin de déterminer l’effet des mutations. Des systèmes rapporteurs enzymatiques permettent de mesurer l’activité des mutants de BvgS et leur réponse aux modulateurs chez Bordetella pertussis. Une autre méthode utilisée pour déterminer l’activité de BvgS est le test Phos-tagTM qui permet la séparation par électrophorèse des formes phosphorylée et non phosphorylée de BvgA, suivie de leur détection par immuno-révélation
Les études de la topologie et la dynamique du segment transmembranaire et des hélices ? entre la membrane et le domaine PAS et entre le domaine PAS et la kinase sont effectuées par cystéine scanning. Les proportions de forme dimérique à l’état basal et après la perception du modulateur reflètent la proximité des deux monomères aux positions ciblées.
Enfin des analyses in silico des séquences des connecteurs trouvés chez les homologues de BvgS de séquence connue sont effectuées pour identifier des motifs communs impliqués dans le mécanisme de transduction.

La structure de la région périplasmique de BvgS montre un dimère intriqué, avec une interface dimérique étendue. Les domaines VFT1 N-terminaux sont ouverts et mobiles selon nos simulations en dynamique moléculaire, alors que les domaines VFT2 sont fermés sans ligand et peu mobiles. La fermeture forcée des VFT1 fait passer BvgS en mode phosphatase. La dynamique des domaines VF1 et sa transmission via les domaines VFT2 au reste de la protéine détermineraient l’activité kinase.
La fixation du modulateur négatif nicotinate à VFT2 modifie la dynamique de la portion périplasmique de façon globale, ce qui engendre la transition de BvgS vers le mode phosphatase. La recherche de ligands physiologiques n’a pas permis jusqu’ici d’identifier de nouvelles molécules plus affines.
Le connecteur entre les domaines PAS et kinase de BvgS adopte la topologie d’un enroulement de 2 hélices parallèles (coiled coil). En mode kinase, ce coil est dynamique, alors que la perception de modulateurs qui déclenche le passage en mode phosphatase réduit sa mobilité et le fait adopter son interface hydrophobe. Notre modèle de régulation d’activité basé sur une balance entre dynamique et rigidité de ce coiled coil pourrait s’appliquer de façon large à cette famille de senseur-kinases.
Des chimères de BvgS portant à la place du domaine PAS des connecteurs d’homologues de BvgS sans PAS ont des phénotypes de régulation variés, qui seraient déterminés par la taille et la composition du connecteur. Une analyse in silico extensive des séquences des homologues de BvgS montre l’existence de deux registres distincts de coiled coils dans ces connecteurs. Nous faisons l’hypothèse que la prédominance de l’un ou l’autre registre et la dynamique résultante du coiled coil dépendent de la perception d’un signal modulateur. Ce mécanisme permettrait la régulation de l’activité de ces senseur-kinases.

Nous avons initié l’étude du connecteur en hélice qui relie les domaines VFT2 et PAS par mutagenèse ciblée et cystéine scanning. Nos résultats suggèrent que la perception de modulateurs par les domaines VFT engendre un mouvement de translation verticale des segments transmembranaires. Cette hypothèse sera testée par des analyses d’accessibilité de résidus cystéine pour déterminer si des résidus enfouis dans la membrane à l’état kinase passent dans la phase aqueuse à l’état phosphatase et vice versa. Nous modifierons aussi la composition des boucles de VFT2 qui seraient en contact avec les têtes polaires des lipides en vue de perturber un mouvement de levier potentiel.
Nous compléterons la caractérisation du domaine PAS. Nous sommes en train de résoudre sa structure par radiocristallographie. L’étape suivante sera de co-cristalliser ce domaine avec des ligands putatifs. Nous avons aussi initié l’analyse de l’interface dimérique de ce domaine par cystéine scanning. Toutes ces données nous permettront d’établir si la fonction du domaine PAS est de faciliter le changement d’état du système ou s’il fixe aussi un ligand cytoplasmique.
Nous poursuivrons l ‘étude des chimères sans domaine PAS. Nous modifierons la stabilité relative des deux registres de coiled coil par mutagenèse pour tester notre modèle de régulation. Nous analyserons les connecteurs d’une ou deux chimères choisies par cystéine scanning dans les états kinase et phosphatase. Les coiled coil seront modélisés in silico et des simulations en dynamique moléculaire réalisées. Nous espérons au terme de ces études pouvoir proposer un modèle général de régulation applicable à la toute famille de BvgS.
Enfin, les données in vivo sur les variants de BvgS fonctionnels sans domaines PAS aideront à construire un modèle qui englobe les segments transmembranaires, le coiled coil et les domaines kinase. Les structures les plus stables serviront de base à la modélisation de la protéine incluant les domaines VFT.

Dupre et al. (2015a) ‘Virulence reguation with Venus flytrap domains : structure and function of the periplamic moiety of the sensor-kinase BvgS’. PLoS Pathogens 11(3):e1004700

Dupre et al. (2015b) ‘Signal transduction by Bvg sensor-kinase : binding of modulator nicotinate affect conformation and dynamics of entire periplasmic moiety’. J Biol Chem 290, 23307-319.

Lesne et al., (2016) ‘Balance between coiled coil stability and dynamics regulates activity of BvgS sensor-kinase in Bordetella’. mBIO 7 :e02089.

de Ruyck et al. (2016) ‘Molecular docking as a popular tool in drug design an in silico travel’. Advances and Applications in Bioinformatics and Chemistry 9, 1-11.

Dupre et al. (Poster) ‘The periplasmic portion of the BvgS sensor-kinase, a new paradigm in signaling’. Sensory Transduction in Microorganisms Gordon Research Conference, 12-17 January 2014, Ventura, CA, USA.

Lesne et al. (Poster) ‘Role of the PAS domain of BvgS, the sensory-kinase that regulates virulence in Bordetella Pertussis.’ Symposium on Metabolism and Bacteria Pathogenesis, 6-9 April 2014, Osnabrueck, Germany.

Lesne et al. (Poster) ‘Signal transduction in BvgS, the sensor-kinase regulating Bordetella pertussis virulence’. ESF-EMBO Symposium « Bacterial networks-BACNET 15 », 9-14 May 2015, Sant Feliu de Guixols, Spain.

Dupre et al. (Poster) ’Designing functional heterodimers to decipher signal transduction in BvgS’ 6th Congress of European Microbiologists - FEMS 2015 - June 7-11, Maastricht, NL.

Wodak, Lensink et al. ‘Prediction of protein-protein interactions in CAPRI: an increasingly integrative approach’, Intl conference on structural genomics, June 2015, Tel Aviv, Israel.

Lensink et al. ‘Assessment of predicted protein complexes’, CASP11 meeting, December 2014, Cancun, Mexico.

Antoine, R. (commun. orale) ‘Signaling by BvgS: a dynamic story’, 11th Intl Bordetella Symposium, April 5-8 2016, Buenos Aires, Argentina.

Les systèmes à deux composants représentent une voie majeure de transduction de signaux chez les bactéries, qui leur permettent de s’adapter en réponse à des changements environnementaux. Ces systèmes régulent des programmes développementaux importants, et notamment l’expression de la pathogénicité de certaines bactéries. Ils se composent typiquement d’un capteur-kinase transmembranaire et d’un régulateur de réponse cytoplasmique. La perception d’un signal physique ou chimique par le capteur déclenche l’autophosphorylation de la kinase dans le cytoplasme, suivie du transfert du groupement phosphoryl au régulateur de réponse; ce dernier déclenche une réponse cellulaire souvent transcriptionnelle. L’agent de la coqueluche Bordetella pertussis colonise le système respiratoire supérieur humain. Son régulon de virulence est contrôlé par le système à deux composants BvgAS. A 37°C et en conditions de laboratoire, BvgAS est actif, conduisant à la transcription du régulon de virulence. La phase de virulence Bvg+ est infectieuse. Le passage à la phase Bvg- est déclenché par des modulateurs chimiques négatifs. Bvg pourrait donc être actif ‘par défaut’ et inactivé par des antagonistes au cours du cycle infectieux de B. pertussis. BvgS est un capteur-kinase hybride avec plusieurs domaines cytoplasmiques impliqués dans une cascade de phospho-transferts. Il possède en outre deux domains périplasmiques de type ‘Venus flytrap’ (VFT) et un domaine PAS cytoplasmique qui précède la kinase. Très répandus dans le monde vivant, les domaines VFT sont formés de deux lobes mobiles qui se referment autour d’une cavité après qu’elle ait fixé un ligand. Ces changements de conformation entre formes ouverte et fermée sont utilises pour déclencher le transport ou la signalisation, comme dans le cas des récepteurs ioniques à Glu des eukaryotes supérieurs. BvgS est le prototype d’une famille de capteurs-kinases à VFT encore peu étudiés. Ces systèmes représentent donc un nouveau paradigme de récepteurs à VFT.
Nous avons obtenu récemment la structure du domaine périplasmique entier de BvgS, qui montre une nouvelle architecture. Ce domaine est dimérique, avec des interfaces très étendues entre protomères. Nos données préliminaires indiquent que les mouvements de fermeture et ouverture des VFT contrôlent l’activité de BvgS, et que les interfaces entre protomères sont essentielles pour sa fonction. Cette nouvelle structure et les outils mis en place pour étudier la fonction de BvgS nous mettent en bonne position pour déchiffrer les mécanismes moléculaires de la signalisation. Nous utiliserons une approche intégrée combinant analyses fonctionnelles, biochimie, biologie structurale et modélisation. Nous identifierons les régions critiques des VFT qui déterminent la conformation active de la protéine et les mécanismes par lesquels les signaux négatifs sont perçus et transmis, par mutagenèse dirigée et tests fonctionnels en bactérie. La conformation et la dynamique de BvgS et ses mutants seront analysées par cristallographie et par modélisation in silico en utilisant des approches de simulation en dynamique moléculaire et à gros grain. Les simulations seront aussi effectuées sur la protéine avec son segment transmembranaire dans un environnement lipidique. La topologie et la dynamique du segment transmembranaire et des segments qui lient ce dernier au domaine PAS et le domaine PAS au domaine kinase seront étudiées par une approche biochimique. La fonction et la topologie du domaine PAS seront déterminées. Notre programme permettra de proposer un modèle qui décrit les mécanismes moléculaires de la signalisation dans BvgS, servant de paradigme pour cette famille de capteurs-kinases. Cette étude fondamentale contribuera à élargir les connaissances et la compréhension des systèmes à deux composants bactériens et jettera les bases pour de nouvelles approches thérapeutiques anti-bactériennes très ciblées.