Mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués dans la formation et la spécialisation des synapses neuronales par les molécules d’adhérence neurexines, neuroligines, et LRRTMs. – SynAdh

L’équipe de O. Thoumine (IINS, Bordeaux) apporte son expertise dans la biologie des molécules d'adhérence synaptiques, les cultures de neurones, l'imagerie haute résolution, les simulations informatiques, et l'électrophysiologie. L’équipe de M. Sainlos (IINS, Bordeaux) apporte son expertise dans la conception, la production et la caractérisation fonctionnelle de peptides modulant les interactions des molécules d'adhérence avec leurs partenaires extra et intracellulaires. L’équipe de P. Marchot et Y. Bourne (Marseille) apporte son expertise dans la caractérisation biochimique, pharmacologique et structurale de complexes de protéines d’adhérence et la conception et la caractérisation fonctionnelle de peptides compétiteurs des interactions extracellulaires.

L’affinité de LRRTM2 pour les neurexines augmente au prorata de la longueur de ces dernières, ce qui assigne un rôle ‘accrocheur’ à leur domaine LNS6 et un rôle ‘stabilisateur’ aux domaines LNS1-5/EGF1-3 pour les partenariats trans-synaptiques.

• La streptavidine monomérique permet le marquage des protéines d’adhérence synaptiques en imagerie de super-résolution, en conjuguant spécificité, accessibilité, absence de réticulation, et faible distance à la protéine cible (Chamma et al, Nat Comm 2016 ; Neurophotonics en révision 2016 ; Nature Protocols, soumis). Grâce à ce nouvel outil, nous avons noué plusieurs collaborations visant à étudier la distribution membranaire de protéines synaptiques (TSPN5 avec Maria Passafaro, Milan ; SynCAM avec T. Biederer, Boston ; récepteur kainate avec C. Mulle, Bordeaux).

• Inspirés par ces approches de dynamique moléculaire, nous avons développé un logiciel informatique basé sur le calcul en temps réel des positions de milliers de molécules individuelles, permettant une modélisation des expériences en imagerie de fluorescence, notamment en super-résolution (Lagardère et al, en préparation). Nous avons eu des contacts avec plusieurs industriels (ExploraNova, Nikon, Leica) pour commercialiser ce logiciel afin d’aider l’expérimentateur dans la conception et l’interprétation de ses expériences en imagerie. Le logiciel servira également à des fins d’enseignement, pour des étudiants en bioimagerie mais aussi vers le grand public.

• Une combinaison d’expériences d’immunocytochimie et d’électrophysiologie nous a permis de montrer qu’un résidu tyrosine unique dans le domaine intracellulaire de la NLGN1 régule la formation des synapses excitatrices versus inhibitrices (Letellier et al., en préparation).

• Des peptides dimériques compétiteurs des interactions entre NLGN1 et ses protéines d’échafaudage (PSD-95, S-SCAM) semblent perturber sélectivement l’assemblage des synapses excitatrices.

Nous allons continuer à développer de nouvelles sondes orthogonales à la streptavidine monomérique pour marquer les protéines membranaires synaptiques, en vue d’établir une cartographie super-résolutive multi-couleurs de la fente synaptique (projet d’Ingrid Chamma, candidate CR2 au CNRS en 2017). Une collaboration a été initiée entre M. Sainlos et U. Rothbauer (Tuebingen) en vue d’utiliser leur nouveau VhH BC2T pour le marquage multi-spectral.

Nous allons également exploiter cette approche pour étudier le trafic membranaire de protéines d’adhérence portant des mutations autistiques, notamment les protéines MDGAs, nouveaux régulateurs des interactions neurexine-neuroligine (consortium ERA-NET Neuron 2015).

Inspirés par les approches de single molecule pull-down apprises à UC Berkeley, nous développons avec Vincent Studer (IINS), en partenariat avec les compagnies Alveole et Nikon une plate-forme permettant de détecter des molécules individuelles greffées sur un substrat, leurs stoechiométries et leurs interactions (financement Labex BRAIN Transfert).

Enfin, nous allons étendre nos approches de physiologie pour étudier l’influence de l’activité synaptique générée par optogénétique, sur la dynamique des adhésions synaptiques dans les tranches de cerveau (recrutement de M. Letellier, initialement porteur de l’ANR Retour-Post-doctorant « SynSpe », à un poste CR1 au CNRS en 2016). Cette approche sera couplée à une imagerie en profondeur via la microscopie à feuille de lumière simple objectif (SoSPIM), en collaboration avec le groupe de JB Sibarita (Bordeaux).

1. CHAMMA I, LETELLIER M, Butler, TESSIER B, Lim KH, GAUTHEREAU I, Choquet D, Sibarita JB, Park S, SAINLOS M*, THOUMINE O* (2016). Mapping the dynamics and nanoscale organization of synaptic adhesion proteins using monomeric streptavidin. Nature Commun, 7:10773. (*Co-last authors).
Highlight dans Nature Methods 13, 290 (2016).

2. CHAMMA I, Levet F, Sibarita JB, SAINLOS M, THOUMINE O. Nanoscale organization of synaptic adhesion proteins revealed by single molecule localization microscopy. Neurophotonics, en révision.

3. CHAMMA I, Rossier O., Giannone G., THOUMINE O*, M. SAINLOS*. (*Co-last authors). Optimized labeling of membrane proteins in confined cellular environments using monomeric streptavidin: applications to super-resolution imaging. En revue at Nature Protocols.

Nous avons mis au point une nouvelle technique de marquage des protéines d’adhérence synaptiques, consistant à remplacer les molécules endogènes par des molécules portant une étiquette de 15 acides aminés N-terminale, permettant l’ajout covalent d’un groupement biotine via une réaction enzymatique catalysée par la biotine ligase. La biotine est alors marquée par une petite sonde, la streptavidine monomérique, conjuguée à une fluorophore organique. Ce marquage est compatible avec la plupart des techniques de super-résolution, et permet une visualisation sans précédent des protéines de la fente synaptique.

4. LETELLIER M, CHAMMA I, SAPHY C, PAPASIDERI I, TESSIER B, SAINLOS M, CZÖNDÖR K, THOUMINE O. A unique tyrosine residue in the intracellular domain of neuroligin-1 regulates excitatory versus inhibitory synapse differentiation. En préparation.

En utilisant des mutants ponctuels de la NLGN1 exprimés dans des cultures de neurones et combinés à des approches de biochimie, immunocytochimie et électrophysiologie, nous montrons qu’un résidu tyrosine unique dans le domaine intracellulaire de la NLGN1 régule la formation des synapses excitatrices versus inhibitrices.

L’assemblage des milliards de synapses permettant la communication entre neurones est une étape essentielle du développement du système nerveux central. En outre, la fonction et la spécificité des synapses en font les cibles de la plupart des troubles neurologiques. Ce projet vise à mieux caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régissent la formation, la maturation et la spécification des synapses. Au niveau de contacts individuels entre axones et dendrites, la synaptogenèse est un processus complexe multi-étapes, initié par l’interaction extracellulaire entre protéines d'adhérence spécifiques et suivi par le recrutement intracellulaire de molécules d'échafaudage et de récepteurs-canaux fonctionnels. Parmi les molécules d'adhérences impliquées dans ces processus, on trouve les neurexines (NRXNs), neuroligines (NLGNs) et les protéines transmembranaires à domaines répétés riches en leucines (LRRTMs). Des codes de reconnaissance entre les divers isoformes et variants d'épissage de ces molécules dictent la spécialisation des synapses excitatrices et inhibitrices, dont l’équilibre est important pour le fonctionnement normal du cerveau. En outre, des mutations pathologiques dans les gènes codant pour les NRXNs, NLGNs et LRRTMs sont associées à l'autisme, au retard mental et à la schizophrénie, soulignant l'importance de ces molécules dans la fonction synaptique. Cependant, les mécanismes par lesquels ces molécules d'adhérence permettent l’assemblage dynamique de synapses fonctionnelles sont encore mal connus. L'étude de la synaptogenèse est freinée notamment par les limites de résolution spatiale de la microscopie conventionnelle, et par l'absence d’agents pharmacologiques à même de promouvoir ou perturber sélectivement la formation et/ou la fonction synaptique. Ce projet vise à remédier à ces limitations via l’observation de la dynamique de ces complexes moléculaires par imagerie super-résolutive, ainsi que par l’élaboration de nouveaux ligands peptidiques conçus d’après les structures 3D des domaines extra- et intracellulaires de ces protéines d’adhérence, suivie de tests fonctionnels en électrophysiologie. Nos résultats apporteront une meilleure compréhension fondamentale du rôle des molécules d’adhérence dans l'assemblage des synapses, ainsi que les informations moléculaires nécessaires à la conception de nouveaux agents thérapeutiques à même d’amoindrir les désordres neuro-développementaux qui leurs sont associés.

Pour consolider ce projet, nous avons construit un consortium multidisciplinaire de trois équipes. L’équipe de O. Thoumine (IINS, Bordeaux) apportera son expertise dans la biologie des molécules d'adhérence synaptiques, les cultures de neurones, l'imagerie haute résolution, et l'électrophysiologie. L’équipe de M. Sainlos (IINS, Bordeaux) apportera son expertise dans la conception, la production et la caractérisation fonctionnelle de peptides modulant les interactions des molécules d'adhérence avec leurs partenaires extra- et intracellulaires. L’équipe de P. Marchot et Y. Bourne (Marseille) apportera son expertise dans la caractérisation biochimique, pharmacologique et structurale des complexes NRXN/LRRTM et la conception et la caractérisation fonctionnelle de peptides compétiteurs des interactions NRXN/NLGN et NRXN/LRRTM extracellulaires.

Ce projet est organisé en trois tâches principales:
Tâche 1. Caractérisation des relations structure-fonction du complexe NRXN/LRRTM extracellulaire, conception de peptides modulant les interactions NRXN/NLGN et NRXN/LRRTM extracellulaires.
Tâche 2. Caractérisation des interactions intracellulaires entre NRXNs, NLGNs, LRTTMs et leurs molécules d'échafaudage (CASK, PSD-95, S-SCAM), conception de nouveaux peptides intracellulaires perturbant ces interactions, et microscopie haute résolution de ces complexes.
Tâche 3: Caractérisation électrophysiologique et biochimique, des mécanismes de signalisation et fonction synaptique médiés par les NRXNs, NLGNs et LRRTMs.