Régulation du trafic membranaire par les GTPases Arf/Rab pour la croissance filamenteuse et la virulence du pathogène fongique Candida albicans – CanDyMemb

Nous avons utilisé une combinaison de génétique et de biologie moléculaire pour générer des mutants « perte de fonction » de C. albicans, ainsi que des rapporteurs pour visualiser la distribution de différentes protéines et lipides, par des méthodes d'imagerie sur cellules vivantes avec une haute résolution spatiale et temporelle. Les rapporteurs générés lient spécifiquement différents phospholipides (phosphatidylinositol phosphates et phosphatidylinositol serine), permettant ainsi une etude de la distribution de ces lipides dans les cellules vivantes dans différentes conditions de croissance, de stress, de stimuli, etc. Utilisant de façon extensive la microscopie sur cellules vivantes, nous avons suivi des décours temporels pour quantifier le trafic membranaire et fait des acquisitions rapides de d’images pour suivre la dynamique des organelles. Les analyses quantitatives de la distribution de signal fluorescent et de mouvement (« tracking ») ont été facilitées par des programmes spéficiques et ont permis de montrer la dynamique de distribution des protéines pendant la morphogenèse.

Pour étudier le rôle des GTPases Arf / Rab chez C. albicans, nous avons généré des mutants de perte de fonction dans 8 de ces GTPases. Parmi les GTPases Arf, seul ARF2 est essentiel pour la viabilité. Nous avons démontré que les mutants arf2 et arl1 sont défectueux pour la croissance invasive. En outre, en réponse au sérum dans un milieu liquide, les mutants arl1 ont une croissance hyphale réduite et forment des filaments plus courts. Le mutant arf2 est très sensible aux perturbants de la paroi cellulaire et aux agents antifongiques, tandis que le mutant arl1 présente seulement une sensibilité accrue aux perturbants de la paroi cellulaire. Les analyses dans des modèles d'infection murins révèlent qu’Arf2 est particulièrement critique pour la candidose systémique alors qu’Arl1 est important pour la candidose oropharyngée. Nous avons analysé le rôle d’Arl1 dans le trafic membranaire et constaté que cette GTPase n’est pas importante pour l'endocytose, mais est critique pour la sécrétion. Le nombre de citernes Golgiennes n'est pas modifié chez ce mutant arl1, mais une diminution ou au contraire une prolifération du nombre de ces citernes est observée respectivement chez le mutant arf2 et le mutant PI-4-kinase pik1. Les cellules du mutant arl1 ont des tubes germinaux multiples, et nous avons démontré, utilisant des rapporteurs de croissance polarisée, que ce mutant est défectueux pour restreindre la croissance à un site unique. De façon intéressante, nous avons observé que la surexpression de la Rab GTPase Ypt6, localisée comme Arl1 au Golgi tardif, restaure le défaut de croissance invasif du mutant arl1. Nous avons par ailleurs montré que le mutant ypt6 a une croissance hyphale réduite, similaire au mutant arl1. Tout récemment, nous avons identifié, par des approches génétiques et biochimiques, des protéines qui interagissent avec Arl1 et Ypt6 et examinons actuellement leur fonction, ainsi que celle de régulateurs potentiels de ces deux GTPases.

Nos études ont identifié une protéine Arf et une protéine Rab critiques pour la croissance filamenteuse de C. albicans. Nous avons identifié des protéines qui interagissent génétiquement et biochimiquement avec ces GTPases et examinons actuellement leurs fonctions. De plus, nous avons montré qu'un transporteur de phospholipide spécifique est ausi critique pour la croissance filamenteuse de C. albicans et nous allons caractériser cette protéine membranaire et examiner si elle est importante pour la virulence.

R. Wakade, H. Labbaoui, D. Stalder, R. A. Arkowitz and M. Bassilana. Overexpression of YPT6 restores invasive filamentous growth and secretory vesicle clustering in a Candida albicans arl1 mutant. Small GTPases. 2017 Sep 29:1-7.

H. Labbaoui, S. Bogliolo, V. Ghugtyal, N. V. Solis, S. G. Filler, R. A. Arkowitz and M. Bassilana Role of Arf GTPases in fungal morphogenesis and virulence. PLoS Pathog 2017 13:e1006205.

T-C. Lin, A. Neuner, D. Flemming, P. Liu, T. Chinen, U. Jäkle, R. A. Arkowitz and E. Schiebel. MOZART1 and ?-tubulin complex receptors are both required to turn ?-TuSC into an active microtubule nucleation template. J Cell Biol 2016 215:823-840

V. Ghugtyal, R. Garcia-Rodas, A. Seminara, S. Schaub, M. Bassilana and R. A. Arkowitz. Phosphatidylinositol-4-phosphate-dependent membrane traffic is critical for fungal filamentous growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2015, 112: 8644-8649.

R. A. Arkowitz and Bassilana M. Regulation of hyphal morphogenesis by Ras and Rho small GTPases. Fungal Biology Reviews. Fungal Biology Rev. 2015, 29: 7-19.

R. A. Arkowitz and Bassilana M. Rho GTPase-phosphatidylinositol phosphate interplay in fungal cell polarity. Biochem. Soc. Trans. 2014, 42:206-11.

Le trafic membranaire cellulaire est médié par le transport vésiculaire entre différents compartiments membranaires. Les organites exocytiques et endocytiques, comme le réticulum endoplasmique, le Golgi, la membrane plasmique et les endosomes, sont connectées par le transport bidirectionnel rapide de vésicules. Les petites protéines G des familles Rab et Arf, qui appartiennent à la superfamille Ras, régulent chacune des étapes de ce trafic chez les eucaryotes. Cette régulation spatio-temporelle est critique pour la croissance et la morphogenèse. Les protéines G de type Arf sont impliquées dans le contrôle du bougeonnement vésiculaire à partir de compartiments donneurs alors que la famille Rab est connue pour réguler le transport vésiculaire, l’attachement et la fusion avec les membranes acceptrices. Des études chez Saccharomyces cerevisiae ont permis de caractériser ces protéines G, mais peu de choses sont connues concernant leur rôle dans la croissance polarisée médiée par un signal externe. De même, leur rôle reste largement méconnu chez les champignons filamenteux.

Ce projet a pour but d'étudier la fonction des GTPases Arf/Rab chez une levure pathogène opportuniste de l'homme, Candida albicans, cause majeure d'infections nosocomiales. Cette levure change dramatiquement de morphologie, pour former des filaments fortement polarisés, en réponse à des stimuli environnementaux, un processus qui est critique pour sa virulence. En outre, au cours de sa croissance filamenteuse, C. albicans présente une structure unique, caractéristique de la croissance hyphale des champignons filamenteux, le Spitzenkörper (accumulation de vésicules). Contrairement à S. cerevisiae, C. albicans n'a pas subi de duplication de son génome et représente donc un modèle plus simple pour étudier le trafic membranaire. En effet, parmi les champignons, C. albicans possède le nombre le plus restreint de Rab GTPases et d’homologues d’activateurs et inactivateurs des protéines Arf/Rab. Ces caractéristiques font de ce pathogène opportuniste un modèle idéal et nouveau pour étudier le rôle de la sécrétion et de l'endocytose lors de la croissance polarisée médiée par un signal externe.

L'objectif de ce projet est de comprendre comment le trafic vésiculaire est régulé lorsque C. albicans est exposé à un stress externe, que ce soit un inducteur de croissance filamenteuse ou un perturbant de la paroi cellulaire. Nous nous concentrerons sur le trafic vésiculaire dans l'appareil de Golgi, la sécrétion à la membrane plasmique et l'endocytose. Nous allons déterminer le rôle des protéines Arf/Rab,- essentiellement 8 d’entre elles -, de leurs activateurs et inactivateurs potentiels, dans la croissance filamenteuse, l'intégrité de la paroi cellulaire et la virulence de C. albicans. Des mutants perte de fonction et de surexpression de ces protéines seront générés. Nos résultats préliminaires ont déjà identifié une protéine Arf clé, nécessaire à la fois pour la croissance filamenteuse et l’intégrité de la paroi cellulaire de cet organisme. Nous suivrons la localisation des GTPases impliquées dans la croissance filamenteuse et/ou l’intégrité de la paroi cellulaire, utilisant des protéines de fusion avec la GFP, dans les cellules sauvages et mutantes exposées au stress correspondant. Pour déterminer où et quand ces protéines sont activées, nous utiliserons de plus des rapporteurs de GTPases activées. Enfin, nous caractériserons les interactions entre ces protéines G et des lipides membranaires critiques (phospholipides et ergostérol) au cours de la réponse à ces stress cellulaires. Spécifiquement, nous déterminerons l'importance de PI(4)P, PI(4,5)P2 et PS pour la fonction et la localisation des Arf/Rab critiques (et inversement). Comprendre la régulation du trafic membranaire au plan moléculaire est d'une importance fondamentale et devrait permettre l'identification de nouvelles cibles anti-fongiques chez cet agent étiologique majeur de maladies nosocomiales.