Mécanismes de la reprogrammation directe in vivo : context permissif et processus nucléaires – CELLSwitch

- Analyse transcriptomique dynamique de la transdifférenciation à l’échelle d’une cellule unique
- Réseau de régulation génique contrôlant l'initiation de la transdifférenciation
- imagerie de cellule unique

Avec son efficacité à 100% et sa reproductibilité, notre modèle nous a permis d'aborder les mécanismes modulant l’invariance et l'efficacité de la reprogrammation naturelle, à l’échelle d'une seule cellule. Grâce à des approches non biaisées, nous avons trouvé que l'équilibre entre les différentes marques de méthylation de l'histone H3 est déterminant pour la progression invariante de la transdifférenciation. Les activités SET1 et JMJD3 qui modifient les histones sont partitionnées en différentes étapes via la régulation dynamique des niveaux de protéine nucléaire JMJD-3 et par l'association avec des facteurs de transcription conservés spécifiques de chaque étape. Enfin, nous avons constaté que la méthylation de H3K4me3 et la déméthylation de H3K27me3 / me2 sont également essentielles pour assurer la protection contre les variations ou contraintes environnementales, assurant ainsi la robustesse de la transdifférenciation. Cette étude est la première à montrer que les modifications successives des histones sont essentielles pour assurer la robustesse d’un processus biologique à étapes multiples tel que la reprogrammation directe naturelle. Nos résultats suggèrent un modèle dans lequel les facteurs de transcription clés assurent la conversion de l'identité cellulaire lors des étapes de dé-différenciation et de re-différenciation alors que la combinaison de différentes modifications d’histone assure son invariance. Finalement, notre travail a suggéré des rôles conservés chez les mammifères pour ces enzymes modifiant les histones (Zuryn et al, Science 2014).

Les résultats découlant de ce projet sont susceptibles de fournir de nouvelles connaissances moléculaires et fonctionnelles sur la machinerie qui permet à une cellule différenciée de changer son identité, et sa conservation.

• Nous espérons d'abord mettre au point de nouveaux outils pour poursuivre des approches de grande envergure de pointe en purifiant des cellules uniques à partir d'animaux entiers ou en automatisant des cribles. Nous nous attendons également à établir la technologie d'expression multiprotéique 2A dans les vers.

• Grâce à une analyse transcriptomique à grande échelle, nous nous attendons à identifier les facteurs qui rendent la cellule Y permissive à la reprogrammation et à mettre en évidence la contribution de la signalisation Notch.

• Nous escomptons définir le réseau nucléaire conservé qui contrôle l'initiation de différents événements de reprogrammation directe in vivo.

• Comme résumé plus haut, nous avons déjà mis en évidence comment les activités épigénétiques influent sur la plasticité au niveau nucléaire.

1. Zuryn S., Ahier A., Portoso M., Redhouse White E., Margueron R., Morin M.C. & Jarriault S. (2014) Sequential histone-modifying activities determine the robustness of transdifferentiation. Science 345(6198):826-829.

2. Ahier A. & Jarriault S.* (2014) Simultaneous Expression of Multiple Proteins Under a Single Promoter in Caenorhabditis elegans via a Versatile 2A-Based Toolkit. Genetics 196(3):605-13.

+ commentaires sur notre travail :
« Worming toward transdifferentiation, one (Epigenetic) step at a time« Beyret E. & Izpisua Belmonte J.C. (2014) Developmental Cell 30(6):641-2.

Comment une cellule spécialisée contrôle son identité cellulaire ou acquière la capacité à changer d'identité est une question fascinante. En effet, des cellules différenciées peuvent être forcées à adopter directement une autre identité différenciée, ou à revenir à l'état pluripotent. De façon encore plus remarquable, des évènements de reprogrammation directe ont également lieu dans la nature. Nous proposons d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui gouvernent la plasticité cellulaire in vivo. Bien que des phénomènes de changement d'identité ont été décrits dans différents contextes, les mécanismes qui sous-tendent ce processus restent peu connus. Leur connaissance aura un grand impact sur notre compréhension des processus développementaux et cancéreux, et pourraient ouvrir de nouvelles perspectives pour la médecine régénérative.

Afin d'identifier systématiquement les molécules, cascades génétiques et les mécanismes cellulaires qui sous-tendent la plasticité cellulaire, nous utilisons un modèle simple, le ver C. elegans. Nous avons tiré partie d'une vieille observation, faite lorsque le lignage cellulaire de ce ver a été décrit et laissée en suspens, qui pouvait laisser supposer que certaines cellules changent d'identité au cours du développement. En nous concentrant dans un premier temps sur un changement d'identité spécifique, nous avons établi C. elegans comme un nouveau modèle pour étudier la plasticité cellulaire. Ce modèle, très attendu, permet en effet d'identifier la même cellule dans différents animaux et de suivre son changement d'identité in vivo, dans un contexte physiologique. De plus, les puissants outils génétiques disponibles chez le ver nous permettent de disséquer ce phénomène au niveau d'une seule cellule, et de mettre en oeuvre des approches systématiques.

Ce modèle nous a permis de mettre en évidence des transitions cellulaires inattendues lors d'un de ces changements d'identité naturels, dont une étape de dédifférenciation apparente, et ce en absence de division cellulaire. Nous avons par ailleurs identifié un complexe conservé, NODE, comme essentiel pour permettre ce changement d'identité. Le complexe NODE est composé de facteurs essentiels pour le maintien de la pluripotence des cellules souches embryonnaires: des mécanismes conservés au cours de l'évolution pourraient sous-tendre le contrôle du potentiel cellulaire in vivo comme ex vivo. De façon excitante, nous avons identifié des activités épigénétiques qui agissent sur la méthylation d'histones, et qui pourraient incarner un tel contrôle. Ainsi, ces résultats importants montrent que i) l'étude d'un évènement de reprogrammation directe chez le ver donne accès à un niveau de détails extraordinaire, en particulier sur les étapes précoces de ce phénomène; ii) l'étude de la plasticité cellulaire chez le ver a déjà révélé, et permettra encore de mettre en évidence des avancées conceptuelles importantes et des mécanismes conservés au cours de l'évolution.

Nous proposons ici un projet original comprenant 4 objectifs, afin de caractériser plus avant ce qui rend une cellule permissive in vivo à la reprogrammation, et quelle base moléculaire commune peut sous-tendre différents évènements de reprogrammation: 1) Par la détermination des mécanismes qui rendent une cellule -mais pas ses voisines- capable de changer d'identité; 2) Par la mise en évidence des réseaux nucléaires conservés ; 3) En déterminant comme la balance entre différentes méthylations contrôle les différentes étapes de la reprogrammation. Pour cela, nous continuerons à tirer partie des outils génétiques et cellulaires puissants que nous avons mis au point. Nous développerons également de nouveaux outils de pointe.

Les résultats que nous obtiendrons devraient être d'un grand intérêt pour une large audience de cheurcheurs travaillant dans les domaines de la plasticité cellulaire, la biologie du développement, les cellules souches, la cancérologie ou encore la médecine régénérative.