Complexes de lanthanide comme nouveaux chevaux de Troie pour la détermination structurale de protéines – Ln23

La méthodologie de ce projet consiste à synthétiser des complexes de lanthanide stables et solubles dans l’eau puis à tester leurs propriétés de nucléation et de phasage en présence de protéines modèles. Cette boucle a été réalisée de nombreuse fois avant de découvrir le cristallophore. Ce composé a ensuite été étudié de manière plus poussée du point de vue de ses propriétés d’interaction supramoléculaire avec les protéines en utilisant la diffraction des rayons X (synchrotron) et des approches théoriques (méthode QM-MM). En parallèle de nouvelle méthodologie d’analyse RMN des interactions Complexe/Protéine ont été mise en place notamment les titrations par DOSY paramagnétique. Cet outil est important pour comprendre le mécanisme de nucléation.
Vu les potentialités exceptionnelle du cristallophore, des collaborations nationales et internationale ont été établies pour valider nos découvertes par d’autres laboratoires. Cette étape validée, une société a été fondée pour la production et la commercialisation de ce composé.

Le projet Ln23 a permis de découvrir un additif exceptionnel pour la cristallographie des protéines dont nous ne mesurons pas encore la portée véritable. Ce complexe de lanthanide est le meilleur additif nucléant et phasant actuellement connus et permet un gain de temps considérable s’il est utilisé en routine pour la cristallographie des protéines. Toutes les preuves de concept ont été établies lors du projet, le produit est commercialisé depuis 2017. Il ne reste plus qu’à réussir à faire en sorte que les habitudes de la communauté des cristallographes change pour faire de ce produit un nouveau standard.

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1. S. Denis-Quanquin, F. Riobé, M.A. Delsuc, O. Maury, N. Giraud Chem. Eur. J. 2016, 22, 18123-18131
2. S. Engilberge, F. Riobé, S. Di Pietro, L. Lassalle, N. Coquelle, C. Arnaud, D. Madern, C. Breyton, O. Maury,* E. Girard*. Chem. Science. 2017, 8, 5909-5917.
3. B. Vögeli, S. Engilberge, E. Girard, F. Riobé, O. Maury, T. J. Erb, S. Shima, T. Wagner. PNAS 2018, 115, 3380-3385
4. S. Engilberge, F. Riobé, T. Wagner, S. Di Pietro, C. Breyton, B. Franzetti, S. Shima, E. Girard,* E. Dumont, O. Maury* Chem. Eur. J. 2018, 24, 9739-9746. r
5. Crystallophore, an efficient additive for protein crystal structure determination. IUCRj. submitted 2018.
6. I. Bernhardsgrütter, B. Vögeli, T. Wagner, P. Dominik, N. S. Cortina, G. Bange,S. Engilberger, F. Riobé, O. Maury, E. Girard, S. Shima, J. Zarzycki, T. J. Erb. Nature Chem. Biol. Submitted 2018
7. Complexe de lanthanide pour la cristallisation de protéine et la détermination de leur structure cristallographique. S. Engilberge, E. Girard, O. Maury, F. Riobé, Fr. Demande (2017), FR 3045606 A1 20170623 PCT Int. Appl. (2017), WO 2017103545 A1 20170622. Licence d’exploitation avec la société Polyvalan
8. Large scale synthesis of FR39 complex D. Pitrat, J.-C. Mulatier, S. Di Pietro, F. Riobé, E. Girard and O. Maury. Enveloppe SOLEAU ref. 557323 déposée le 28/01/2016.
9. Nouveaux complexes d’ions métalliques pour la cristallisation macromolécules biologiques et la détermination de leur structure cristallographique C. Chapelle, S. Engilberge, E. Girard, O. Maury, F. Riobé, Fr. Demande (2017) FR1770467 déposé le 06/05/2017

Le succès retentissant de la détermination complète du génome humain en 2000 a ouvert la voie à un domaine de recherche plus vaste encore : la génomique structurale qui consiste à déterminer la structure des protéines pour comprendre les relations entre leur structure et leurs fonctions. De par le nombre et la variété de protéines existantes, il s’agit d’un chantier énorme dont nous ne soupçonnons pas la portée en termes de retombées scientifiques et médicales.
Aujourd’hui, les deux outils pour cette résolution structurale sont la cristallographie et résonance magnétique nucléaire (RMN). Il s’agit de deux techniques complémentaires qui présentent des avantages et des limites : (i) la RMN permet l’analyse en solution de protéines mais requiert un enrichissement isotopique; (ii) la cristallographie permet une détermination plus rapide de structures mais reste tributaire de la préparation de cristaux de bonne qualité. Actuellement l’effort de recherche est focalisé sur le développement de très grands instruments au détriment de la recherche de nouvelles méthodologies.
Dans ce contexte, ce projet propose une méthodologie originale fondée sur les complexes de lanthanides, notés [Ln], utilisés pour leur propriétés de diffuseurs anomal permettant la résolution du problème des phases en cristallographie des protéines et pour leur propriétés d’anisotropie magnétique permettant l’émergence de la cristallographie par RMN du solide paramagnétique.
Le projet Ln23 propose d’utiliser les [Ln] ainsi que leur propriétés physiques intrinsèques comme cheval de Troie pour la détermination structurale de protéines en développant une méthodologie intégrative, efficace et utilisable pour trois techniques structurales complémentaire : la cristallographie, la diffusion aux petits angles et la RMN. L’objectif est de faire connaitre cet outil dans la communauté de la biologie structurale et de remplacer les méthodes anciennes basées sur le Sélénium. Cela permettrait un gain de temps important, une amélioration significative de la précision pour la détermination de structures de protéines et par conséquence conduirait à une utilisation optimale des grands instruments disponibles.
Le cœur du projet Ln23 a pour objectif de comprendre et quantifier les interactions supramoléculaires entre [Ln] et protéines, un domaine de recherche quasi vierge à ce jour. Pour nous envisageons de concevoir des [Ln] présentant des charges, formes, fonctionnalités variées et susceptibles de former des interactions avec des protéines, issues de la famille des malates deshydrogénase qui sont connues pour présenter une structure homogène mais des charges de surfaces très diverses. Les co-cristallisation seront réalisées en utilisant des techniques robotisées à haut débits et la formation d’adduits cristallins [Ln]–protéine sera révélée grâce aux propriétés de luminescence des éléments f. Finalement, les constantes d’affinités thermodynamiques seront déterminées sur des modèles moléculaires de complexité croissante.
En s’appuyant sur la compréhension de ces interactions il sera possible rationaliser la cristallisation entre [Ln] et protéines permettant de nouveaux développements cristallographie et en RMN du solide paramagnétiques. Il sera également possible d’éviter au contraire de telles interactions et de confiner les complexes de lanthanide dans les canaux de solvants permettant ainsi de développer des méthodes structurales à basse résolution basée sur le contraste de solvant (MASC). Les meilleurs complexes seront proposés pour collaboration à la communauté de biologie structurale et commercialisés par la société NatX-ray avec qui nous travaillons déjà.
Finalement le contrôle des interactions [Ln]-protéine et le développement de ces outils analytique permettra de s’attaquer rapidement à des problémes réels de biologie structurale comme la résolution de structures de protéines solubles inconnues, de protéines membranaires voire de grands assemblages macromoléculaires.