Blanc SVSE 8 - Blanc - SVSE 8 - Biochimie, biologie moléculaire et structurale

Etudes structurales et fonctionnelles des complexes multi-protéiques de la voie NHEJ humaine – NHEJ-complexes

Mécanisme moléculaire de réparation des cassures double-brin de l’ADN et Cancers

En premier lieu, les machineries cellulaires impliquées dans une voie majeure de réparation chez l’homme des cassures double-brin de l’ADN seront produites à l’aide de méthodes innovantes. Dans un second temps, les mécanismes moléculaires de cette voie de réparation seront étudiés avec un large ensemble d’approches structurales et fonctionnelles.

Production et structures atomiques des machineries de réparation des cassures double-brin.

Le premier objectif du projet ANR est de produire les sept protéines qui sont au cœur de la reconnaissance, de la maturation et de la re-ligature des deux extrémités d’ADN générées lors d’une cassure double-brin. Le second objectif majeur sera la caractérisation du mécanisme moléculaire de ces machineries en action pendant la réparation de la cassure double-brin.

Tâche 1 : Conduite du projet. Une première réunion de l’ensemble des partenaires a été programmée. Tâche 2 : Les premières productions de deux complexes ont été réalisées ; Tâche 3 et 4 : Deux complexes de la voie de réparation des cassures doule-brin ont été étudiés par microscopie et par cribles haut-débit de conditions de cristallisation. Tâche 5 : Un nouvel essai de réparation de l’ADN in cellulo.

Les premiers essais de production réalisés dans cette période ont permis d’exprimer et de purifier des milligrammes de deux complexes multiprotéiques. Ces deux complexes ont été utilisés dans des cribles de cristallisation haut débit et pour des analyses par microscopie. Plusieurs compagnies pharmaceutiques ont également exprimé leur intérêt pour le projet ANR NHEJ-complexes.

Premièrement, les expériences d’expression et de production réalisées sur les complexes multiprotéiques de la voie de réparation humaine des cassures double-brin de l’ADN ont confirmé la robustesse et l’efficacité des méthodes innovantes développées par le Partenaire 4; Deuxièmement, les premiers résultats très encourageants obtenus en production des complexes indiquent que les études structurales proposés dans ce projet bénéficieront de large quantité des complexes multiprotéiques ciblés

Un premier manuscrit est en cours de préparation par le Partenaire 3 sur les analyses par microscopie électronique et à force atomique réalisées sur les premiers complexes multiprotéiques en présence d’ADN. Les partenaires 1 et 4 ont publié des articles s

Les cassures double-brin de l'ADN (CDBs) sont parmi les lésions les plus toxiques de l'ADN. Chez les mammifères, les CDBs sont réparées principalement par la voie NHEJ (pour Non-Homologous End Joining). La voie NHEJ est également impliquée dans les processus de réarrangement des gènes des immunoglobulines et des récepteurs des cellules T, appelé recombinaison V(D)J. La voie NHEJ fait intervenir au moins sept protéines qui forment, entre elles, trois complexes multi-protéiques: le complexe de reconnaissance (Ku70/Ku80), le complexe de préparation des extrémités (DNA-PKcs/Artemis) et le complexe de ligation (LigaseIV/Xrcc4/Cernunnos). Chez l'homme, un défaut de la voie NHEJ est associé à des immunodéficiences sévères (appelées SCID). Le Partenaire 2 a identifié ces dernières années, deux protéines majeures de la voie NHEJ humaine, l'ADN nucléase Artemis et le facteur de ligation Cernunnos (appelé également XLF), en complémentant des cellules de patients SCID par des ADNc humains (Moshous, 2001, Cell; Buck, 2005, Cell).
Les protéines du NHEJ ont fait l'objet individuellement de nombreuses études structure-fonction, notamment au travers des travaux des Partenaires 1, 2 et 3. Il apparait aujourd'hui essentiel d'étudier dans leur ensemble les complexes multi-protéiques de la voie NHEJ afin de caractériser leur mécanisme moléculaire tout au long de la réparation des CDBs. Un objectif majeur du projet est la production des trois complexes de la voie NHEJ. Ce projet s'appuiera sur l'approche MultiBac développée par le Partenaire 4 pour l'expression en cellules d'insectes de complexes multi-protéiques eucaryotes. Cette approche a été utilisée récemment avec succès pour l'étude structurale de large complexes multi-protéiques (Imasaki, 2011, Nature; Yamada, 2011, Nature). Parmi les protéines du NHEJ devant être produites, DNA-PKcs est la cible la plus ambitieuse avec 4128 acides aminés, ce qui en fait la plus grande kinase humaine connue. Des protéines de cette taille (dynein 520kDa, NF1 320kDa, Smg1 400kDa) ont récemment été produites avec succès par l'approche MultiBac (Bieniossek, 2011, TIBS). Le second objectif du projet est l'étude structurale et fonctionnelle des complexes du NHEJ purifiés au cours de ce projet ou déjà purifiés pour certains d'entre eux par le Partenaire 1.
Le projet intégrera de nombreuses approches complémentaires: (i) cristallographie et SAXS (Partenaire 1), (ii) microscopie électronique et à force atomique (Partenaire 3), (iii) mesures in vivo et in vitro de réparation de l'ADN (Partenaire 2) et enfin (iv) méthodes avancées de production des complexes multiprotéiques (Partenaire 4). Le projet s'appuiera sur une collaboration de longue date entre les Partenaires 1 et 2 sur le complexe de ligation du NHEJ humain (Malivert, 2010, J Biol Chem). Cette collaboration s'est étendue récemment au Partenaire 3 dans le cadre de l'étude structurale du complexe Xrcc4/Cernunnos par cristallographie et microscopie électronique. Ces travaux ont permis de mettre en évidence un arrangement en filaments du complexe Xrcc4/Cernunnos (Ropars, 2011, PNAS).
L'objectif est aujourd'hui d'étudier la structure à haute résolution du complexe entier de ligation, LigIV/Xrcc4/Cernunnos et d'étendre progressivement nos études sur les autres complexes de la voie NHEJ. Notre consortium possède tous les outils et les expertises nécessaires pour aborder les questions ambitieuses proposées. La retombée principale attendue pour ce projet est une description précise sur le mécanisme moléculaire des complexes multi-protéiques du NHEJ. Ce projet répond également à des enjeux sociétaux importants car la réparation des CDBs est une voie majeure de résistance de certaines cellules tumorales aux chimio- et radio-thérapies classiques (Friesen, 2008, Mol Biol Cell). Notre projet permettra à terme de développer de nouvelles classes d'inhibiteurs de la voie NHEJ et d'augmenter significativement l’efficacité de traitements anti-cancer.

Coordinateur du projet

Monsieur Jean-Baptiste Charbonnier (UMR 8221) – JB.CHARBONNIER@cea.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CNRS UMR 8221
Inserm Inserm U768
CNRS UMR 8126
EMBL EMBL Grenoble

Aide de l'ANR 480 000 euros
Début et durée du projet scientifique : septembre 2012 - 36 Mois

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