Blanc SVSE 2 - Blanc - SVSE 2 - Biologie cellulaire et biologie du développement

Des cellules souches aux gamètes : rôle de CUL-2 dans l’établissement et le maintien de la lignée germinale de C. elegans – CRL2INGSC

Comprendre le rôle de la dégradation régulée des protéines au cours du développement des organismes multicellulaires, notamment dans la mise en place de la lignée germinale

L’expression anormale de protéines régulatrices est à l’origine de nombreuses pathologies humaines. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle du système ubiquitine-protéasome, qui contrôle la stabilité des protéines, dans l’établissement et le maintien de la lignée germinale, et plus largement, dans le développement des organismes multicellulaires.

Identifier les cibles du complexe CRL2 dans la lignée germinale et l’embryon de C. elegans

Nous avons mis en évidence un rôle essentiel du système ubiquitine-protéasome dans l’établissement et le maintien de la lignée germinale, mais également, dans le développement embryonnaire chez C. elegans. En particulier, nous avons montré qu’un complexe E3-ligase organisé autour de la culline CUL-2 (CRL2) est essentiel pour le développement de la lignée germinale et de l’embryon précoce. L’objectif majeur de ce projet est d’identifier les cibles de ce complexe dans la lignée germinale et l’embryon précoce en utilisant des approches protéomiques, génétiques et de biologie cellulaire. En particulier, nous implémenterons le développement de nouvelles approches protéomiques chez C. elegans. <br />Comprendre le rôle du système ubiquitine-protéasome dans la lignée germinale, et notamment, dans la régulation de la balance entre prolifération des cellules souches germinales et différenciation méiotique revêt d’une importance capitale car de nombreuses évidences indiquent que des défauts dans les mécanismes qui contrôlent la prolifération et la différenciation des cellules souches germinales sont à l’origine d’infertilité et de cancers chez l’homme.

Le nématode C. elegans est un organisme multicellulaire simple, facile à entretenir au laboratoire, permettant une analyse aisée du système ubiquitine-protéasome au cours du développement en utilisant une combinaison d’approches génétiques et de biologie cellulaire. Cependant, l’utilisation d’approches protéomiques est très limitée et ce pour plusieurs raisons. Premièrement, il n’existe pas à l’heure actuelle de méthode permettant de purifier aisément des protéines ubiquitinées chez C. elegans. Deuxièmement, l’obtention du matériel biologique en quantité suffisante est souvent un frein à ce type d’approche. Alors que le modèle C. elegans a largement contribué à l’identification des enzymes du système ubiquitine-protéasome, que de nombreux substrats on été identifiés dans ce système grâce à des approches génétiques, aucun site d’ubiquitination n’a été identifié à ce jour. L’avènement de méthodes permettant d’éditer le génome (CRISPR/Cas9) de C. elegans renforce l’importance d’identifier de nouveaux substrats du système ubiquitine-protéasome ainsi que les lysines modifiées de ces substrats afin d’étudier plus précisément le rôle du système ubiquitine-protéasome.
Nous avons donc mis en place des stratégies permettant de purifier des protéines ubiquitinées. Premièrement, nous avons généré grâce au système CRISPR une lignée de C. elegans exprimant l’ubiquitine en fusion avec une étiquette 6xHis permettant de purifier des protéines ubiquitinées en conditions dénaturantes. Ceci constitue la levée d’un verrou technologique car pour la première fois, nous sommes en mesure de purifier et d’identifier des protéines ubiquitinées par spectrométrie de masse chez C. elegans.
Deuxièmement nous avons identifié, de manière globale, de nombreux sites d’ubiquitination sur de nombreux substrats potentiels du système ubiquitine-protéasome.

Au cours de ce projet nous avons identifié la protéine SPAT-1 comme étant une nouvelle cible de CUL-2 chez C. elegans. SPAT-1 est un activateur de la kinase PLK-1, qui est requise pour le développement de la lignée germinale et l’entrée en mitose dans l’embryon précoce de C. elegans. Nous avons étudié la régulation de SPAT-1 et avons montré que la phosphorylation de SPAT-1 par la kinase mitotique Cdk1/CyclinB déclenche l’interaction de SPAT-1 avec PLK-1 et la phosphorylation de PLK-1 sur sa boucle d’activation par la kinase Aurora A ce qui conduit à activer PLK-1. Ainsi activé, PLK-1 déclenche l’entrée en mitose dans l’embryon précoce. La régulation de SPAT-1, est conservée chez l’humain puisque nous avons montré que la phosphorylation de Bora (homologue humain de SPAT-1) par Cdk1/CyclinB déclenche de la même façon la phosphorylation de Plk1 par Aurora A. Un manuscrit est actuellement en révision dans la revue de biologie cellulaire The Journal of Cell Biology.
Afin d’identifier les cibles de CUL-2 de manière globale, nous avons généré une lignée exprimant l’ubiquitine fusionnée à une étiquette 6xHis qui permet de purifier des protéines ubiquitinées dans des conditions dénaturantes, qui préservent ces chaines d’ubiquitine conjuguées aux substrats. Cette lignée sera très utile pour la communauté car ce réactif n’a pas encore été développé chez C. elegans. Nous avons également identifié de manière globale plus de 8000 sites d’ubiquitination en collaboration avec Cell Signalling (Boston). En résumé, au cours de cette première phase du projet, nous avons identifié une nouvelle cible de CUL-2 et avons généré les outils permettant l’identification des cibles de CUL-2 et du système ubiquitine-protéasome par des approches globales. Ces approches viendront complémenter les approches génétiques.

Notre travail visant à identifier des cibles du système ubiquitine-protéasome et à comprendre leur régulation au cours du développement de la lignée germinale et de l’embryon précoce de C. elegans a de nombreuses implications. Premièrement, aucune stratégie de protéomique globale n’a été envisagée pour identifier des cibles du système ubiquitine-protéasome chez C. elegans. Par conséquent, il est vraisemblable que plusieurs études seront initiées sur la base de nos travaux. Deuxièmement, la plupart de nos résultats seront sans doute transposables à l’homme dans la mesure ou la plupart des gènes qui contrôlent la prolifération et la différentiation des cellules germinales ainsi que le développement embryonnaire sont conservés chez l’homme. Par exemple, nous avons montré que la régulation de PLK-1 par SPAT-1 pour contrôler l’entrée en mitose est identique chez C. elegans et dans les cellules humaines.

- Mise en évidence d’un rôle du complexe CRL2 dans l’établissement et le maintien de la lignée germinale (Burger et al. PLoS Genetics 2013).
- Identification de SPAT-1 comme étant un nouveau substrat de CUL-2 (en préparation) et étude de la régulation de SPAT-1 (Tavernier et al. The Journal Of Cell Biology, en révision).
- Génération d’une lignée de nématode exprimant l’ubiquitine en fusion avec une étiquette 6x(His) par le système CRISPR/Cas9 (en préparation)
- Identification systématique des sites d’ubiquitination chez C. elegans (en préparation)

Les cellules souches germinales sont le support de la fertilité, de l'hérédité et de l'évolution. Pour assumer ces fonctions, elles prolifèrent par cycle mitotique pour générer une population de cellules souches germinales puis entrent en méiose pour former des gamètes. Une régulation extrêmement précise de la transition mitose-méiose permet de maintenir un réservoir de cellules souches germinales. En effet, une prolifération anormale de ces cellules peut conduire à la formation de cancers alors qu’une entrée précoce en méiose peut entrainer une stérilité. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires qui coordonnent la transition entre prolifération et différentiation des cellules germinales est nécessaire pour appréhender les bases moléculaires de l’oncogénèse mais également, pour comprendre l’origine de la stérilité chez l’individu adulte.
Les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la balance entre prolifération mitotique et différentiation méiotique des cellules germinales ont été principalement étudiés dans des organismes modèles comme la drosophile et le nématode C. elegans. Dans les deux cas, des mécanismes de régulation post-transcriptionnels sont impliqués dans la régulation de la transition mitose/méiose. Par exemple, chez C. elegans, la voie de signalisation Notch contrôle l’expression des protéines de liaison à l’ARN FBF-1/2 (Pumilio) qui répriment dans la région distale de la gonade, où les cellules germinales prolifèrent, l’expression de facteurs requis pour la différentiation méiotique. En particulier, FBF-1/2 réprime l’expression de GLD-1 et GLD-3, des protéines de liaison à l’ARN, et de GLD-2 une polyA polymérase. Les protéines FBF-1/2 répriment également l’expression des facteurs requis pour l’appariement des chromosomes homologues et la formation du complexe synaptonémal.
Outre ces mécanismes post-transcriptionnels de régulation, des mécanismes post-traductionnels coordonnent la prolifération et la différentiation méiotique des cellules germinales. En effet, nos résultats récents indiquent que le système ubiquitine-protéasome jour un rôle majeur dans ce processus. En particulier un complexe E3 ubiquitine-ligase, organisé autour de la culline 2 et utilisant la protéine LRR-1 comme adaptateur de substrat, contrôle la prolifération des cellules germinales (Merlet et al. Development 2010) et inhibe la différentiation méiotique en ciblant notamment la dégradation de la protéine HTP-3, qui est requise pour l’entrée en prophase de méiose (Burger et al. Under review). Cependant, HTP-3 n’est pas le seul substrat de LRR-1 qui pourrait cibler également GLD-1 vers la dégradation. En outre, LRR-1 contrôle la prolifération des cellules germinales, cependant, les mécanismes par lesquels LRR-1 accomplit cette fonction restent à découvrir. Enfin nos résultats indiquent que la kinase Cycline E/Cdk2, qui est active dans les cellules souches germinales mais réprimée dans les cellules méiotiques, phosphoryle les cibles de LRR-1 pour les cibler vers la dégradation.
Notre objectif est maintenant i) d’identifier les cibles de LRR-1 dans les cellules germinales ii) de mettre au point un système permettant l’expression conditionnelle de ces cibles afin d’analyser l’importance fonctionnelle de leur dégradation, iii) de reconstituer l’ubiquitination des substrats avec des composants purifiés afin d’étudier le rôle de la kinase Cycline E/Cdk2 dans la dégradation des substrats. Nous utiliserons pour cela une combinaison d’approches génétiques, biochimiques, de biologie cellulaire et de protéomique quantitative. Ce travail permettra de comprendre les mécanismes par lesquels les cellules germinales prolifèrent ou se différencient pour entrer dans un cycle méiotique et former des gamètes. CUL-2 et LRR-1 sont conservées au cours de l’évolution et donc ce travail effectué dans un organisme modèle sera vraisemblablement applicable à d’autres espèces et éventuellement à l’homme.

Coordinateur du projet

Monsieur LIonel PINTARD (Institut Jacques Monod - CNRS) – lionel.pintard@ijm.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

IJM - PINTARD Lionel - CNRS Institut Jacques Monod - CNRS
CRBM - CNRS Centre de Recherche en Biochimie Macromoléculaire

Aide de l'ANR 383 500 euros
Début et durée du projet scientifique : août 2012 - 36 Mois

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