Analyse du mécanisme de méthylation de l’ADN impliquant UHRF1 et DNMT1 par de nouveaux outils en fluorescence – fluometadn

Pour atteindre nos objectifs, la spectroscopie de fluorescence nous est apparue comme la technique de choix, du fait de sa très grande sensibilité (permettant de travailler à faibles concentrations en solution) et sa capacité de suivre de manière site-spécifique des changements conformationnels au site de liaison des deux partenaires. La grande difficulté dans notre cas est que nous voulions suivre ces modifications au niveau de l’ADN, ce qui requiert de marquer ce dernier par un rapporteur fluorescent. Cet objectif est très difficile à atteindre car il n’existait pas au début de notre projet de rapporteur fluorescent capable de remplacer sans perturbation une base naturelle, tout en gardant de fortes propriétés émissives et une grande sensibilité aux variations de son environnement. Un des objectifs majeurs a donc consisté à synthétiser de tels rapporteurs sur la base d’une famille de fluorophores présentant un spectre d’émission à deux bandes, très sensible à l’environnement. En incorporant ces rapporteurs dans des ADN double brin à différentes positions par rapport au site de liaison portant la base méthylée, nous avons caractérisé leur liaison avec UHRF1 par spectroscopie de fluorescence, mais aussi par une méthode d’écoulement à flux bloqué qui permet de suivre par fluorescence la cinétique d’interaction suite au mélange rapide des deux partenaires.

Nous avons synthétisé de nouveaux analogues fluorescents de nucléosides et avons démontré leur très grande sensibilité aux changements environnementaux. Des séquences incorporant en différentes positions un de ces analogues ont été synthétisées afin d’étudier la première étape du mécanisme de méthylation de l’ADN. Pour deux positions, le rapporteur perturbe a minima la conformation du duplexe et sa liaison avec la protéine. Des études de fluorescence ont permis de suivre la cinétique de liaison du domaine SRA de UHRF1 ainsi que le basculement de la base méthylée dans son site de reconnaissance. Les résultats obtenus ont été consolidés par des études avec des mutants de SRA. Nos données permettent de mieux comprendre le mécanisme de recrutement de la DNMT1 par UHRF1 et donnent des pistes de développement de nouveaux inhibiteurs. Enfin, ce travail a permis d’initier de nouvelles collaborations avec des partenaires internationaux : Y. Tor (USA) et O. Fedorova (Russie) afin d’explorer de nouvelles questions sur UHRF1 et de proposer de nouvelles applications avec les rapporteurs fluorescents du projet.

Deux résultats majeurs ont été obtenus. Le premier concerne la synthèse d'une série d'analogues fluorescents de nucléosides, capables de caractériser et de quantifier des interactions protéines/acides nucléiques. Le second porte sur la description fine des mécanismes de liaison et de basculement de bases par UHRF1. Les deux ont un impact scientifique important. Les analogues fluorescents de nucléosides permettront de répondre à de nombreuses questions dans le domaine très vaste des interactions protéines/acides nucléiques. Ils ont déjà été utilisés pour suivre le mécanisme de l'endonucléase VIII et les propriétés chaperonnes vis à vis des acides nucléiques de la protéine de la nucléocapside de HIV-1. La compréhension des étapes initiales de la réplication du patron de méthylation de l'ADN est elle aussi importante, nous permettant de mieux comprendre le mécanisme de basculement de la base méthylée et le recrutement de la DNMT1. Avec ces mêmes outils, il sera maintenant possible d'étudier ce recrutement et la coopération entre les deux protéines lors de la réplication du patron de méthylation. Par ailleurs, à la fois le basculement de la base méthylée par UHRF1 le recrutement de la DNMT1 sont des cibles évidentes pour concevoir de nouvelles stratégies pour prévenir la propagation de profils de méthylation altérés dans les cancers.

L’ensemble de ce travail a donné lieu à treize articles publiés et sept articles soumis à publication ou en préparation. Une grande partie de ces articles concerne le développement et la caractérisation des nouveaux analogues fluorescents de nucléosides. Deux papiers traitent de l’interaction d’UHRF1 avec les ADN hémiméthylés marqués par un rapporteur fluorescent. Ce travail a servi également de support à deux thèses, une en chimie (Nicolas Barthès, Université de Nice) et une en biophysique (Vasyl Kilin, Université de Strasbourg).

De nombreux mécanismes cellulaires tels que la réplication, la traduction, la réparation de l’ADN, la méthylation de l’ADN et le silençage de gènes impliquent des complexes multimoléculaires d’acides nucléiques et de protéines. Grâce à la capacité qu’ont les techniques fondées sur la fluorescence d’atteindre le seuil de détection d’une molécule unique et grâce à l’extrême sensibilité de certains fluorophores à leur environnement, la spectroscopie de fluorescence est une technique de choix pour caractériser les mécanismes moléculaires et les dynamiques de ces complexes multimoléculaires. Cependant, cette technique est limitée par la disponibilité de sondes de fluorescence optimisées, capables de suivre de manière sensible, site-spécifique et multiparamétrique les changements conformationnels d’acides nucléiques durant leur interaction avec leurs partenaires protéiques. Dans ce contexte, nous proposons de développer de nouveaux outils basés sur des sondes fluorescentes sensibles à l’environnement de la famille des 3-hydroxychromones (3HC), pour étudier par des techniques de fluorescence de pointe la dynamique et le mécanisme de la méthylation de l’ADN par le couple de protéines UHRF1/DNTM1, qui joue un rôle clé dans la réplication de l’ADN en transferrant le patron de méthylation du brin d’ADN parent au brin d’ADN néo-synthétisé. En outre, du fait de son rôle dans les mécanismes épigénétiques, la protéine DNTM1 a été identifiée comme une cible pour combattre les cancers, qui sont souvent accompagnés d’une altération du patron de méthylation. Par conséquent, la caractérisation des étapes moléculaires impliquées dans la transmission du patron de méthylation devrait i) révéler de nouveaux aspects mécanistiques pouvant être potentiellement ciblés dans des stratégies anti-cancers et ii) suggérer de nouveaux essais pouvant être utilisés pour cribler des molécules anti-cancéreuses. Une première génération d’analogues nucléosidiques fluorescents à base de 3HC a déjà été synthétisée et démontrée comme possédant les propriétés d’une base universelle. Cette génération n’induit qu’une déstabilisation limitée des ADN dans lesquels elle est insérée et répond par un changement du rapport des deux bandes d’émission à la liaison de protéines, donnant ainsi la preuve de concept de notre approche. Ce projet hautement interdisciplinaire à l’interface chimie/biophysique sera mené par deux partenaires hautement complémentaires. Le partenaire 1 est un expert en spectroscopie de fluorescence et en sondes 3HC, ainsi qu’en interactions protéines/acides nucléiques et en protéine UHRF1. Par conséquent, le partenaire 1 sera chargé de la sélection des chromophores 3HC pour le développement d’analogues nucléosidiques fluorescents, de la caractérisation des propriétés photophysiques de ces analogues ainsi que des oligonucléotides fluorescents et de l’étude des étapes moléculaires impliquées dans la méthylation de l’ADN par le couple UHRF1/DNTM1. Le partenaire 2 est spécialisé en chimie organique et médicinale, dans la conception de sondes fluorescentes et la chimie des acides nucléiques. Le partenaire 2 sera chargé de la conception et de la synthèse des nouveaux outils de fluorescence de ce projet et de leur intégration dans des oligonucléotides par synthèse en phase solide.