Oxygène singulet : du dégât sur les protéines vers le développement de bio-détecteurs et générateurs – SOxygen

Nous avons choisi de combiner plusieurs méthodes biophysiques distinctes, car l’effet de l’oxygène singulet sur les protéines est hétérogène. Nous allons utiliser une méthode structurale à haute résolution, la cristallographie en combinaison avec la spectrométrie de masse qui pourra détecter de faibles variations de masse des protéines, et la spectroscopie optique, qui permettra de quantifier l’endommagement de certains échantillons.

Toutes les informations glanées au cours de ce projet devraient nous renseigner sur deux aspects complémentaires, l'un de recherche fondamentale, l'autre de développement biotechnologique. Nous allons ainsi pouvoir fournir de nouvelles idées pour faire évoluer des protéines capables de détecter ou de générer de l’oxygène singulet, tout en nous donnant un aperçu des effets de l'oxygène singulet sur l’ensemble des protéines. En somme, notre but est de le domestiquer afin d’exploiter ses aspects bénéfiques.

Non-applicable après 6 mois de projet (voir paragraphe précédent)

Nous avons publié un article dans Acta Crystallographica D : Biological Crystallography sur une étude structurale d’une protéine fluorescente qui montre que le chromophore de la protéine est bien moins abrité du solvant qu’on ne le pensait auparavant. En effet, en protégeant des cristaux de protéine en ajoutant la petite molécule éthylène glycol, nous avons observé qu’elle pénétrait très rapidement l’intérieur de la protéine, à proximité du chromophore fluorescent. Ce résultat a des implications sur la photo-sensibilisation de l’oxygène en DRO (dérivés réactifs de l’oxygène) tels. que l’oxygène singulet.
‘Alteration of fluorescent protein spectroscopic properties upon cryoprotection’ par David von Stetten, Gaëlle O. Batot, Marjolaine Noirclerc-Savoye et Antoine Royant, Acta Crystallogr. D, sous presse.

L'oxygène singulet (ou SO, pour ‘singlet oxygen’) est une des espèces réactives de l'oxygène les plus difficiles à caractériser dans les conditions physiologiques. Bien que ses natures physique et chimique aient été étudiées de façon intensive au cours des 75 dernières années, ce qui lui a donné un rôle significatif en chimie de synthèse, de nombreuses interrogations sur son implication dans les processus biologiques restent présentes : l’oxygène singulet est-il impliqué dans l’explosion oxydative des phagocytes de mammifères, en même temps que l’ion superoxyde et le peroxyde d’hydrogène ? Comment le SO, en endommageant certaines protéines, contribue-t-il au vieillissement général ? Comment la signalisation par le SO fonctionne-t-elle chez les plantes ?

L’oxygène singulet est devenu ces dernières années un sujet de recherche pour le développement d’outils biotechnologiques. Comme il présente des propriétés d’inactivation non-spécifique de biomolécules, la mise au point d’une protéine de fusion, codée génétiquement, qui puisse générer une quantité significative de SO présente un intérêt considérable. Une telle protéine trouverait de nombreuses applications en biologie cellulaire dans des expériences de CALI (inactivation de protéine par la lumière assistée par un chromophore). Une autre application biotechnologique importante est son utilisation pour la colocalisation de protéines à haute résolution par corrélation de microscopies électronique et de fluorescence. Enfin, le développement d’un détecteur du SO codé génétiquement serait précieux pour l’étude de son rôle physiologique.

A l’Université de Californie à San Diego, le Professeur Roger Tsien, lauréat du Prix Nobel de Chimie 2008, est un pionnier de ces outils depuis une dizaine d’années. Certains résultats n’ont pas encore été publiés, et sont très prometteurs. Le coordinateur du projet, Antoine Royant, s’est familiarisé avec ces outils lors d’un séjour dans son laboratoire. Il est convaincu que ces outils peuvent être améliorés grâce à la biologie structurale. A l’Institut de Biologie Structurale, nous disposons d’une compétence de niveau mondial sur la coordination entre cristallographie de rayons X et spectroscopies optiques pour la compréhension du mécanisme de protéines. Cette expertise est matérialisée par le laboratoire ‘Cryobench’ et ses liens étroits avec les lignes de cristallographie des protéines du Synchrotron Européen ESRF, l’un des trois synchrotrons de haute brillance dans le monde.

Ce projet présente deux aspects complémentaires, l’un de recherche fondamentale, l’autre de développement biotechnologique. D’un côté nous proposons d’utiliser une combinaison de techniques comprenant la spectroscopie optique, la spectrométrie de masse et la cristallographie de rayons X pour cartographier les effets spécifiques de l’oxygène singulet sur une des classes de biomolécules, les protéines. Cela fournira un cadre dans lequel comprendre comment une protéine peut détecter ou générer de l’oxygène singulet. Nous considèrerons ensuite des systèmes basés sur des protéines, développés récemment, qui ont la capacité de détecter ou de générer l’oxygène singulet. Nous les améliorerons par mutagenèse semi-aléatoire puis nous testerons leur utilité in vivo. L’ensemble des résultats du projet nous donnera un tableau complet des effets de l’oxygène singulet sur les protéines et nous aidera à le domestiquer pour exploiter ses aspects bénéfiques.