Etude Biophysique, biochimique et biomoléculaire de la paroi des levures. – AFMYST

Le projet AFMYST a pour but de visualiser la paroi des levures en utilisant le microscope à force atomique. Deux verrous technologiques sont identifies. Le premier réside dans l’immobilisation de cellules pour l’AFM. La tache 1 est dédiée au développement des techniques d’immobilisation pour l’AFM (un article soumis). Le deuxième réside dans la biofonctionnalisation des pointes AFM. Nous développerons une méthode de Biofonctionnalisation, basée sur les dendrimères, qui a déjà donné lieu à un brevet.

Notre première tâche a été de développer un outil à la fois efficace et versatile d’immobilisation des cellules vivantes pour l’AFM, utilisable pour les levures de l’espèce Saccharomyces cerevisiae mais aussi pour Candida albicans. Ce développement ouvre des perspectives intéressantes vers des applications biomédicales. Une collaboration avec l’institut Pasteur de Paris est en cours de mise en place pour étudier les protéines de surface de C. albicans.
D’autre part, nous avons étudié l’effet des stress thermique, alcoolique et antifongique sur la paroi des levures, ce qui nous conduit à une meilleure connaissance de ses modes d’adaptation (publié dans Antimicrobial Agent and Chemotherapy, Formosa et al., 2013). Ces travaux intéressent les industriels des biotechnologies tels que Lallemand SA, qui a depuis financé une thèse CIFRE pour caractériser la paroi de ses souches industrielles sur les plans biochimiques et biophysiques.
Une autre technique, permettant de sonder les interactions à l’échelle de la molécule unique est la pince optique. Son application à la cellule vivante est un nouveau challenge que l’équipe de Marit Sletmoen en Norvège (Université de Trondheim) a commencé à relever. Nous avons établi une collaboration internationale sur l’étude des interactions à l’échelle de la molécule unique, à la surface des levures, étudiées par pince optique. Ce travail fait l’objet d’une demande de financement IDEX « Transversalité » de l’Université de Toulouse, et constituera la base d’une prochaine demande de financement à l’ANR.

Le projet nous ouvre les voies d’application biomédicale. La levure Saccharomyces cerevisiae est un modèle d’étude interessant de levures pathogènes comme Candida albicans. Mieux comprendre les effets de diférents stress sur la paroi de S. cerevisae pourrait ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques.
Parallèlement, cette connaissance intéresse également les industriels qui produisent de la paroi de levure et souhaitent valoriser ce produit (comme probiotique ou comme filtre pour des polluants par exemple).

-Dague E., et al., 2011. 22. 395102 Nanotechnology
-Jauvert E.*, et al., 2012., Sensors and Actuators 168. 436-441
-Formosa C., et al., 2012. Scientific Reports (Nature Publishing Group) 2. 575
-Dague E., et al., Pointe de microscope à force atomique modifiée et biomodifiée, 2010 n° dépôt 10 57932, 30/09/2010
-Chopinet L., et al., 2013 Micron 48. 26-33
-Formosa C., et al., 2013. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 57. 3498-3506
-François J.-M., et al., 2013. Current Genetics 59, 187-196
-Pillet F., et al., 2014. BMC Biology 12, 6.
-Pillet F., et al., 2014. Biochimica and Biopysica Acta General Subjects 1840, 1028-1050
-Schiavone M., et al., In Press. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts, FEMS Yeast
-Formosa C., et al., In Press. Multiparametric imaging of adhesive nanodomains at the surface of C. albicans by Atomic Force Microscopy Nanomedicine NBM
-Formosa C., et al., In Press. Mapping HA-tagged protein at the surface of living cells by atomic force microscopy. Journal of Molecular recognition
-Formosa C., et al., A versatile method to generate living cells arrays for Atomic Force Microscopy studies Nature Protocol Accepted
-Elsztein C., et al., François J.M., Biophysical properties of wild type strain and yap1 mutant in response to ethanol shock (to be submitted)

Le projet transdisciplinaire AFMYST se positionne à l’interface de la biologie, de la chimie et de la physique. La question biologique posée concerne l’organisation et la morphogénèse de la paroi des levures Saccharomyces cerevisiae. Cette paroi cellulaire a été essentiellement étudiée par des méthodes de biochimie ou de biologie moléculaire. Notre objectif est d’apporter à cette connaissance les observations en microscopie à force atomique donnant accès à la biophysique de la paroi. Des résultats préliminaires obtenus sur des mutants pour les différents sucres composant la paroi montrent la pertinence de cette approche. Le rôle de chaque constituant de la paroi (polysaccharides et protéines) dans l’organisation et la morphogénèse sera évalué en réalisant des mesures de rugosité de surface et de nanomécanique, par AFM. L’effet de stress (thermique, osmotique, ionique, antifongique) sera également évalué. Dans un deuxième temps notre attention sera focalisée sur les protéines de surface et sur leur cartographie à la surface de la paroi. Pour ce faire les pointes AFM seront fonctionnalisées par les anticorps dirigés contre les protéines de surface pour réaliser des expériences de spectroscopie de force à l’échelle de la molécule unique sur des cellules vivantes. Le but ici est de cartographier quatre protéines : Flo11 de la famille des protéines Flo impliquées dans les phénomènes d’adhésion à des surfaces ou entre cellules ; Cwp1, une mannoprotéine impliquée dans l’organisation de la paroi, Pir1 de la famille des protéines Pir nécessaires à la stabilité de la paroi, et Gas1 qui porte une activité beta-1.3 glucanosyltranferase nécessaire à l’assemblage de la paroi.
Enfin les cibles pariétales et le mécanisme d’action de molécules antifongiques (la caspofungine, et la toxin killer 9) seront étudiés grâce à des pointes AFM fonctionnalisées par ces molécules.
Ce projet transdisciplinaire rassemble 3 jeunes chercheurs, dont deux émanent de l’équipe NanoBioSystèmes du LAAS –CNRS dirigé par Liviu Nicu (E. DagueCR2-CNRS et C. Thibault MDC INSA), le troisième, de l’équipe de physiologie Microbienne moléculaire du LISBP (H Martin-Yken CR1 - INRA). Ces trois jeunes chercheurs présentent des compétences complémentaires. Le LISBP a une forte expertise dans le domaine de la paroi des levures alors que le LAAS-CNRS a l’expertise en AFM et micro-nano-fabrication. De plus, ce projet constitue aussi une rampe de lancement au sein de l’Institut Technologies Avancées des Sciences du Vivant (ITAV) qui a vocation à héberger des projets transdisciplinaires et de rupture technologique.
Le projet est organisé en 5 tâches. La première, consiste à développer et optimiser les méthodes d’immobilisation des cellules vivantes pour leur étude en microscopie à force atomique. La deuxième est consacrée à la biophysique de la paroi dans les différentes conditions de stress. La troisième, est dédiée au développement de la chimie de surface nécessaire à la bio fonctionnalisation des pointes AFM qui seront utilisées dans la 4ème tache intitulée analyse fonctionnelle de la paroi, consistant à cartographier des protéines d’intérêt à la surface des cellules vivantes et à étudier la cible d’action de molécules antifongiques. La 5ème tâche est une tâche de coordination et management qui sera réalisée par le coordinateur du projet, E Dague Les résultats seront principalement valorisés sous forme de publications scientifiques
Le coordinateur du Projet, E Dague est né en 1978, Phd, Docteur en pharmacie, lauréat de l’académie de pharmacie, chargé de recherche du CNRS depuis 2007. Il est l’auteur de 19 publications scientifiques dans le domaine de l’AFM appliqué aux cellules vivantes.
La demande d’équipement concerne l’amélioration d’un AFM et d’un système de dosage des sucres constituants la paroi des levures.
La demande de moyen humain concerne un post-doctorant qui sera impliqué dans les tâches 2 à 4