Dérivation de cellules pluripotentes induites (iPS) humaines normales et pathologiques en photorécepteurs: applications thérapeutiques pour les rétinites pigmentaires. – GPiPS

L’approche de reprogrammation offre l’opportunité de customiser des lignées de cellules iPS pour évaluer rapidement leur engagement et leur différenciation dans les lignages rétiniens. Nous construisons ainsi des lignées d’iPS exprimant un fluorochrome différent en fonction de leur stade d’engagement dans le processus de différenciation rétinienne et plus spécifiquement en photorécepteurs.

Production de lentivirus où l’expression d’un flurochrome est sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’un phénotype rétinien : promoteur de Vsx2 (progéniteurs de la rétine neurale), de Crx (précurseurs des photorécepteurs) et de la rhodopsine (photorécepteurs à bâtonnet).
Dérivation par reprogrammation « non intégrative » de cellules iPS exprimant la EYFP et la protéine mCherry sous le contrôle respectif du promoteur de Vsx2 et Crx.
Optimisation des conditions de culture permettant de produire des progéniteurs rétiniens et des photorécepteurs.

L’utilisation de ce type de lignées iPS customisées à partir de patients souffrant de RP permettra de décortiquer les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la perte des photorécepteurs dans ces RP spécifiques. Des tests pourront être développés à partir de ces cellules afin de procéder à des cribles de molécules à potentiel thérapeutique

en cours

La possibilité de reprogrammer des cellules somatiques en cellules pluripotentes (iPS) offre un énorme potentiel en médicine régénérative. Dans les pathologies touchant la rétine, et plus particulièrement les rétinites pigmentaires (RP) liées a une perte des photorécepteurs, la transplantation de cellules permettant la restauration de la vision peut être considérée comme une approche alternative à la thérapie génique, aux vues de l’hétérogénéité étiologique touchant les patients souffrant de RP. Par ailleurs la génération de cellules iPS de patients souffrant de RP offre une opportunité pour étudier dans un modèle in vitro les effets d'un gène déficient dans le développement rétinien humain.
L’utilisation des cellules souches pluripotentes nécessite une compréhension détaillée des processus développementaux qui sous-tendent la formation de la rétine et l’identification des facteurs clés impliqués dans la différenciation des photorécepteurs. Cette approche est actuellement développée dans l’équipe d’O. Goureau à l’Institut de la Vision (INSERM UMR_S968) en utilisant différentes approches transcriptomiques et par la mise au point d’un protocole permettant la différenciation des cellules ES humaines en photorécepteurs en collaboration avec l’INSERM UMR861-IStem (Drs C. Monville et Y. Laabi). La participation du CIC503 du CHNO des Quinze-Vingts, associé au centre des maladies rares, qui est centralisé sur les pathologies de la rétine, permettra de générer de cellules iPS de patients souffrant de RP.
L’objectif principal de ce projet est de développer des études précliniques indispensables au développement de thérapies cellulaires en ophtalmologie utilisant les cellules iPS. Nous souhaitons ainsi i) reprogrammer des keratinocytes issus de cheveux de patients sains et souffrant de RP en cellules iPS, ii) développer des lignées reportrices de cellules iPS permettant de produire de produire et d’isoler efficacement des précurseurs des photorécepteurs à partir de ces lignées et iii) développer des modèles humains in vitro de RP (inexistants actuellement) à partir des cellules iPS de patients atteints de RP.
L’utilisation des cellules iPS offre l’opportunité de customiser des lignées de cellules iPS pour évaluer rapidement leur engagement et leur différenciation dans les lignages rétiniens. Nous construirons ainsi des lignées d’iPS exprimant un fluorochrome différent en fonction de leur stade d’engagement dans le processus de différenciation rétinienne et plus spécifiquement en photorécepteurs. Cette lignée exprimera une « casette fluorescente reportrice » qui contient les gènes codant pour les protéines fluorescentes eCFP, eYFP ou Cherry, respectivement sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’un phénotype rétinien particulier, Chx10 (progéniteurs de la rétine neurale), Nrl (précurseurs des photorécepteurs) et rhodopsine (photorécepteurs à bâtonnet).
Cette lignée de cellules iPS- [Chx10p-eCFP / Nrlp-eYFP / Rhop-Cherry] nous permettra également de purifier rapidement des cellules au phénotype désiré afin d’obtenir une population cellulaire homogène, pour des études plus fines de caractérisation moléculaire (transcriptome, antigènes de surface,…) et des études de transplantation in vitro dans des explants rétiniens. Nous produirons ces lignées iPS customisées à partir de keratinocytes de patients sains mais également de patients souffrant de RP (mutation identifiée sur le gène de la rhodopsine et sur celui du facteur de transcription crx). L’utilisation des iPS portant la mutation de type RP nous permettra de décortiquer les mécanismes moléculaires et cellulaires qui sous-tendent la perte des photorécepteurs dans ces RP spécifiques. Nous chercherons ainsi à identifier des biomarqueurs cellulaires accompagnant ces pathologies en comparant les lignées iPS natives et mutantes par différentes approches (transcriptome, cytometrie en flux, …)