Des mécanismes impliquant une régulation post transcriptionnelle contrôlent la sécrétion de Type 3 chez la bactérie phytopathogène Ralstonia solanacearum – PATHO-SWITCH

Dans un premier temps, nous avons recherché quels facteurs de virulence de la bactérie étaient capables d’interagir directement avec la protéine HpaP. Pour cela nous avons réalisé des tests d’interaction en « double-hybride » chez la levure, avec un crible assez large de recherche d’interactions directes sur plus de 40 facteurs de virulence avec HpaP. Dans un second temps, nous avons étudié le rôle de la protéine HpaP sur la sécrétion de ces facteurs de virulence (appelés également effecteurs). Par des cinétiques de sécrétion, une première approche a été ciblée sur quelques effecteurs (utilisation d’anticorps spécifiques), puis nous avons analysé le sécrétome « le plus complet possible » de R. solanacearum avec une seconde approche plus globale (expériences de spectrométrie de masse). Les sécrétomes d’une souche sauvage et de différents mutants hpa (dont hpaP) ont été comparés. Un lien entre les différents sécrétomes et les réponses sur plantes a été recherché. Pour cela, les mutants des chaperonnes candidates étudiées ont été inoculés sur plusieurs plantes hôtes de R. solanacearum, appartenant à différentes familles botaniques.

La protéine HpaP module la sécrétion de facteurs de virulence de R. solanacearum. HpaP est requise pour la sécrétion de l’effecteur PopP1, avec lequel elle interagit directement et spécifiquement. En absence d’une protéine HpaP fonctionnelle, les symptômes de maladie sont très significativement affectés sur plusieurs plantes hôtes. Des analyses comparatives de sécrétomes de la souche sauvage et de mutants de chaperonnes ont mis en évidence leur rôle dans le pouvoir pathogène de la bactérie, notamment par un contrôle extrêmement précis de la sécrétion de plusieurs substrats et de l’injection in planta des effecteurs.

Nous avons identifié une protéine candidate potentiellement impliquée dans les phénotypes étudiés. Nous sommes ainsi à la dernière étape de validation/invalidation de son rôle comme responsable du phénotype « perte de virulence du mutant hpaP sur M. truncatula ». Cette protéine pourrait être intéressante en tant que molécule de biocontrôle pour lutter contre R. solanacearum. A l’issue des expérimentations en cours, nous verrons si ces données sont valorisables (brevet) et si des applications peuvent être envisagées.

Les travaux réalisés ont conduit à la publication de deux articles de recherche dans des journaux internationaux à comité de lecture (Lohou et al., 2014, Molecular Plant Pathology, 15 (6):601-614 ; Lonjon et al., 2016, Molecular and Cellular Proteomics, 15:598-613). Deux revues ont également été rédigées sur cette période, une première présentant l’état de l’art de la bactérie étudiée, R. solanacearum (Peeters et al., 2013, Molecular Plant Pathology, 14:651-662) ; une seconde ciblée sur les protéines de type chaperonnes chez les bactéries phytopathogènes (Lohou et al., 2013, Frontiers in Plant Science, Nov 22; 4:435).

Le pouvoir pathogène de Ralstonia solanacearum, agent responsable du flétrissement bactérien, s’exerce notamment au travers de plus d’une centaine de protéines sécrétées, certaines dépendant directement de la fonctionnalité d’un appareil de sécrétion de Type 3. Ces protéines sécrétées, appelées également Effecteurs de Type 3 (ET3s) seraient pour la plupart injectées dans la cellule végétale pour atteindre des protéines cibles. Un rôle important de ces ET3s serait d’empêcher la mise en place de mécanismes de défense de la plante, pour réorienter la physiologie cellulaire dans un sens favorable au développement de la bactérie. Alors que plusieurs études reportent l’implication de régulateurs transcriptionnels clés dans le contrôle du Système de Sécrétion de Type 3 (SST3), des régulations au niveau de la sécrétion sont très peu décrites.

Des résultats préliminaires nous ont permis de montrer par la protéine HpaP (hrp-associated protein), codée par le cluster de gènes hrp, participerait à la régulation de la sécrétion des ET3s chez R. solanacearum. Nous avons identifié que la mutation du gène hpaP chez la souche de référence GMI1000 conduisait à une perte totale de virulence lors de l’inoculation de la légumineuse modèle Medicago truncatula. De manière intéressante, le mutant hpaP est toujours capable d’induire une réponse hypersensible sur tabac, et induit la maladie sur tomate, avec toutefois un retard lors de la mise en place des symptômes. Cette perte complète de virulence sur M. truncatula s’accompagne d’un effet «dominant négatif » sur le pouvoir pathogène de R. solanacearum. En effet, la co-inoculation de la souche sauvage GMI1000 et du mutant hpaP sur M. truncatula inhibe toute multiplication bactérienne in planta, empêchant l’établissement de la maladie. Nous avons montré par d’autres travaux que la protéine HpaP aurait un rôle de régulateur/modulateur dans le processus de sécrétion des effecteurs bactériens. Plusieurs protéines ont été détectées par spectrométrie de masse comme sécrétées différentiellement entre la souche sauvage GMI1000 et la mutant hpaP. Notre hypothèse de travail est que la protéine HpaP de R. solanacearum aurait un rôle d’«interrupteur biologique», modulant de manière post-transcriptionnelle la sécrétion d’ET3s.

Ce projet PATHO-SWITCH vise dans un premier temps à comprendre comment R. solanacearum, via HpaP, contrôle et hiérarchise la sécrétion d’ET3s. Dans un second temps, nous rechercherons le ou les T3Es dont la régulation de sécrétion via HpaP est primordiale pour le pouvoir pathogène de la bactérie sur M. truncatula. Enfin, nous mettrons l’emphase sur un ou deux T3Es, afin de décortiquer le processus de hiérarchie de sécrétion/injection et de mieux comprendre le processus infectieux de cet agent pathogène majeur.