JCJC SVSE 5 - JCJC : Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques

Machinerie de la Hsp90 et sa modulation via de nouvelles sondes moléculaires : aspects structuraux, dynamiques et fonctionnels – MACHsp90

Machinerie de la Hsp90 et sa modulation via de nouvelles sondes moléculaires : aspects structuraux, dynamiques et fonctionnels

Les oligomères de la Hsp90 : une nouvelle vue sur les machineries de chaperonnage de la Hsp90

Régulation du processus oligomérisation par protéines co-chaperons, sélection inhibiteurs originaux Hsp90 analogues Novobiocine et rôle oligomères dans processus agrégation type amyloïde

En septembre 2007 dans son bulletin épidémiologique hebdomadaire Institut National de Veille Sanitaire (INVS) a annoncé que pour la première fois en France, le cancer est la cause majeure de décès devant les maladies cardiovasculaires. En effet, le taux d’incidence des cancers a doublé entre 1980 et 2005. De ce fait, le développement de nouveaux traitements novateurs agissant par de nouveaux mécanismes et ciblant de nouvelles cibles apparaissent nécessaires. Dans cette optique, la Hsp90 apparaît comme une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement des cancers mais aussi depuis peu dans les maladies neurodégénératives. L’objectif général de notre travail avait pour but d’étudier la fonction de la Hsp90 et de sélectionner de nouveaux inhibiteurs chimiques. Ce travail se décomposait en trois parties. Dans la première partie de notre travail, nous avons étudié le processus d’oligomérisation de la Hsp90 et l’influence sur celui-ci de deux co-chaperons Aha1 (activateur) et p23 (inhibiteur). Dans la deuxième partie de notre travail, nous avons produit de nouveaux inhibiteurs de la Hsp90 dérivés de la Novobiocine, ces molécules ont été sélectionnées par rapport à leur solubilité et leur interaction spécifique avec la Hsp90. Dans la troisième partie de notre travail, nous nous sommes focalisé sur la capacité de la Hsp90 à réguler les processus d’association de type amyloïdes, in vitro. Nos travaux apportent de nouvelles connaissances sur la fonction de la Hsp90 et notamment sur l’implication des oligomères dans le cycle de chaperonnage, nous avons sélectionné de nouveaux inhibiteurs potentiel de la Hsp90 dont l’activité anti-tumorale sera prochainement testée sur des lignées de cellules cancéreuses.

Concernant les études pourtant sur le processus d’oligomérisation de la Hsp90 et l’influence des protéines co-chaperons, un des prérequis à été d’optimiser un protocole de pontage chimique afin de stabiliser les différents complexes dans le but de déterminer leur stœchiométries d’interaction. Une fois les complexes stabilisés, nous avons combiné des techniques biochimiques et biophysiques telles que l’ultracentrifugation analytique, la chromatographie d’exclusion stérique couplée ou non à la diffusion de lumière laser à angles multiples ainsi que la spectrométrie hautes masses. La spectrométrie hautes masses a notamment été essentielle pour comprendre comment les complexes se formaient. En ce qui concerne les inhibiteurs dérivés de la Novobiocine, nous avons élaboré un protocole de sélection basé comprenant plusieurs étapes : leur solubilité dans le diméthylsulfoxyde et en milieu aqueux, leur capacité à se lier à la Hsp90 et spécifiquement à son domaine C-terminal et nous allons prochainement tester leur activité antiproliférative sur différentes lignées de cellules cancéreuses. Pour cette partie du travail, nous avons utilisé des techniques biophysiques telles l’ultracentrifugation, la spectrophotométrie, la fluorimétrie et nous mesurons l’effet des molécules sur la croissance cellulaire pour déterminer leur activité antiproliférative (IC50). Dans la troisième partie de notre travail, nous avons utilisé les techniques biophysiques citées précédemment ainsi que la microscopie électronique à transmission pour caractériser le processus de fibrillation des peptides amyloïdes et l’effet de la Hsp90 sur< ces processus.

L’originalité de notre projet résidait dans le fait que nous nous intéressons aux roles des oligomères de la Hsp90. En effet, nous pensons que ces oligomères sont les formes actives en temps que chaperons moléculaires, les résultats que nous avons obtenus vont dans ce sens. En nous basant sur l’interaction de la Hsp90 avec ses protéines co-chaperons régulateurs Aha1 and p23, nous pouvons proposer un nouveau modèle de fonctionnement et de régulation du cycle de chaperonnage de la Hsp90. Concernant les inhibiteurs de la Hsp90 dérivés de la Novobiocine, à partir de la soixantaine de molécules synthétisées, une vingtaine d’entre-elles ont été pré-sélectionnées, quatre sont actuellement testées quant à leur activité antiproliférative sur lignées cellulaires cancéreuse. Ces nouvelles molécules sont potentiellement de nouveaux médicaments qui seront utilisables dans le traitement des cancers. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons démontré que la Hsp90, et probablement sous forme oligomérique, est capable de réguler les processus de fibrillation de type amyloïde. Les inhibiteurs dérivés de la Novobiocine et spécifiques de la Hsp90 sont aussi des médicaments potentiels dans le traitement des maladies neurodégénératives de type amyloïde.

A compléter

L’optimisation du protocole de pontage chimique à été publié dans “Analytical chemistry”. Concernant le processus d’ oligomérisation de la Hsp90 et l’influence de ces co-chaperons a donné lieu à deux autres publications dans des journaux internationaux: “

Les protéines chaperons jouent un rôle essentiel dans la vie de la cellule, notamment par leur implication dans le processus de repliement des protéines néo-synthétisées. Parmi elles, la protéine de choc thermique de 90 kDa (Hsp90) joue un rôle particulier. Dans des conditions normales, la Hsp90 ne semble pas participer directement au repliement de novo des protéines, mais permet, avec l’aide de co-chaperons, à certaines protéines cibles d’acquérir leur conformation active. En condition de stress, la Hsp90 est surexprimée suggérant un rôle protecteur au niveau cellulaire. Si la Hsp90, protéine chaperon, est indispensable au bon fonctionnement de cellules saines, une telle activité représente un inconvénient dans la lutte contre le cancer, car la protection de protéines mutées conduit à la survie de cellules cancéreuses. C’est pourquoi la Hsp90 s’est révélée être une cible prometteuse pour de nouvelles stratégies de thérapies anticancéreuses, avec pour objectif d’enrayer simultanément de nombreuses voies d’oncogenèse. La compréhension du cycle de chaperon de la Hsp90 constitue par conséquent un défi majeur. Le cycle de la Hsp90 est étroitement lié à des changements importants de conformation. Notre compréhension de ces changements repose principalement sur les informations structurales qui se réfèrent aux états cristallins de la protéine Hsp90 recombinante tronquée et de son homologue procaryote HtpG. Nous avons récemment publié les premières structures de Hsp90 eucaryote entière observées en l’absence de nucléotides (apo-Hsp90), révélant ainsi la flexibilité intrinsèque de cette protéine. Bien que les changements de conformation aient été précédemment attribués à la liaison des nucléotides, nous avons montré qu’ils résultaient de la flexibilité intrinsèque du dimère de Hsp90. Ainsi, en tenant compte des propriétés dynamiques du dimère de Hsp90, nous avons revu le cycle ATP dépendant de la Hsp90. En marge de cette structure dimérique, la Hsp90 s’oligomérise en présence de cations divalents et sous l’influence d’une augmentation de température. Ces oligomères participeraient aussi au cycle de chaperonnage. Pour déchiffrer les détails de ce cycle, les inhibiteurs constituent des outils particulièrement intéressants. Dans le cas de la Hsp90, il en existe deux types. Les inhibiteurs appartenant à la famille de la geldanamycine (GA), qui sont actuellement les plus étudiés, et ceux dérivant de la novobiocine (Nvb). Des études ont démontré que chacune de ces deux classes d’inhibiteur agissait de manière différente sur le cycle de chaperonnage de la Hsp90. (Keppler, 2006, Fan and Young, 2006). En associant ces inhibiteurs à des nano particules d’or, nous disposerons de sondes moléculaires efficaces nous permettant d’étudier le mode de fonctionnement de la Hsp90. Le but principal de ce projet est de caractériser les bases moléculaires de l’action de la novobiocine et de ces dérivés les complexes Hsp90/co-chaperons et Hsp90/protéines clientes. Dans le but d’élucider clairement la structure et la dynamique de la Hsp90 au cours de son cycle de chaperonnage, ainsi que de comprendre des modulations de ce cycle, nous proposons un projet d’étude associant des compétences complémentaires en pharmaco-chimie et biologie structurale. En utilisant les approches structurales les plus modernes telles que la cristallographie aux rayon X et la cryo-microscopie électronique, nous comptons étudier différents homo (oligomères) et hétéro-complexes formés par la Hsp90, ses co-chaperons et/ou protéines cibles. L’influence des inhibiteurs sera étudiée afin de comprendre les détails du cycle de la Hsp90 au niveau moléculaire. Les résultats obtenus au cours de cette étude contribueront à la compréhension de l’activité oncogène de la Hsp90 et permettront le développement et/ou l’optimisation d’inhibiteurs pouvant être utilisés afin de traiter des cancers.

Coordinateur du projet

Monsieur Cyrille GARNIER (CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE BRETAGNE ET PAYS- DE-LA-LOIRE) – cyrille.garnier@univ-rennes1.fr

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

UMR-CNRS 6026 CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE BRETAGNE ET PAYS- DE-LA-LOIRE

Aide de l'ANR 199 996 euros
Début et durée du projet scientifique : - 48 Mois

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