Blanc SVSE 5 - Sciences de la vie, de la santé et des écosystèmes : Physique, chimie du vivant et innovations biotechnologiques

Identification et caractérisation moléculaire des signaux de sécrétion des protéines de virulence sécrétées par de système de sécrétion de type 2 bactérien – SecPath

SecPath

Identification et caractérisation moléculaire des signaux de sécrétion des protéines de virulence sécrétées par des systèmes de sécrétion de type 2 bactériens.

Comprendre le mécanisme de la sécrétion pour mieux lutter contre les bactéries pathogènes.

Les systèmes de sécrétion de type II (T2SS) permettent à de nombreuses bactéries pathogènes de sécréter des protéines de virulence. Malgré de nombreuses études antérieures, le motif de reconnaissance des exoprotéines par les T2SS est encore inconnu. L’objectif de ce projet est de caractériser les éléments structuraux qui permettent à une protéine d’être reconnue par un T2SS parmi toutes les protéines présentes dans le périplasme et d’identifier les éléments du T2SS responsables de la reconnaissance de ces signaux. Cette étude devrait permettre de comprendre les mécanismes moléculaires de la spécificité des T2SSs et pourrait aider à la conception de petites molécules qui, en interagissant avec les signaux de sécrétion ou les composants des systèmes, iraient bloquer la sécrétion de facteurs de virulence chez les bactéries pathogènes.

Ce projet utilise une approche interdisciplinaire qui nous donnera des réponses du niveau moléculaire au niveau cellulaire. Nous tirons avantage de nos expertises complémentaires et employons de méthodes variées allant de la protéomique, la génétique, la biochimie, la microbiologie à la modélisation in silico et la cristallographie aux rayons X. Une autre originalité du projet est l’utilisation de deux modèles bactériens (le pathogène humain Klebsiella oxytoca et la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi) et d’un panel de protéines sécrétées.

Pour comprendre les mécanismes moléculaires de la reconnaissance des exoprotéines par le T2SS, nous examinons deux faces de ce phénomène : 1) identification et caractérisation des éléments structuraux des protéines sécrétées qui constituent les signaux de sécrétion : analyse structure-fonction de PelI, Pel3 et PulA (détermination de la structure 3D, mutagenèse dirigée systématique, échange de domaines protéiques) ; étude in silico et développement d’un serveur dédié à l’analyse structurale de plusieurs protéines sécrétées par le T2SS ; 2) identification et caractérisation des éléments du système de sécrétion impliqués dans la reconnaissance des protéines sécrétées et caractérisation de leurs sites d’interaction : approche systématique (pontage dirigé in vivo, suppresseurs) et approche ciblée (double hybride, pull-down, spectroscopie RMN).

Une meilleure compréhension des mécanismes de sécrétion par le T2SS et la détermination de la base moléculaire de la spécificité de la sécrétion vont non seulement élargir nos connaissances, mais aussi ouvrir une voie à l’élaboration de nouveaux agents anti-bactériens bloquant la sécrétion. La réalisation de ce projet pourrait aider à la conception de petites molécules qui, en interagissant avec les signaux de sécrétion ou les composants des T2SS, iront bloquer la sécrétion. Ces composés pourraient être une alternative aux antibiotiques pour lutter contre les bactéries pathogènes.

1. Gu S., Rehman S., Wang X., Shevchik V.E., Pickersgill R.W. (2012) Structural and functional insights into the pilotin-secretin complex of the type II secretion system. PLoS Pathog. 8(2): e1002531. doi:10.1371/journal.ppat.1002531.
2. Gu S., Kelly

De nombreuses bactéries à Gram négatif utilisent des stratégies d’invasion communes et partagent les mêmes machineries cellulaires pour envahir les plantes et les animaux. Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement exploité par les pathogènes de l’homme, des animaux et des plantes (Vibrio, Klebsiella, Pseudomonas, Yersinia, Erwinia, Xanthomonas…) pour sécréter des toxines et des enzymes lytiques. Ces facteurs de virulence sécrétés sont directement impliqués dans la destruction des tissus de l’hôte, facilitant l’infection et l’invasion.
La sécrétion par le T2SS se passe en deux étapes. Les exoprotéines sont synthétisées avec une séquence signal N-terminale et traversent la membrane cytoplasmique par le système Sec ou Tat. Une fois dans le périplasme elles se replient et sont transportées à travers la membrane externe par le T2SS, une nano-machine composée de 12 à 15 protéines. Bien qu’ils soient étudiés chez de nombreuses bactéries, leur architecture et mode de fonctionnement ne sont pas encore compris. Les protéines sécrétées par le T2SS n’ont pas de motif de sécrétion linéaire apparent et en dépit de nombreuses tentatives pour comprendre les mécanismes de leur reconnaissance, le signal de sécrétion n’a toujours pas été identifié. Ce signal semble être composé de motifs structuraux ce qui nécessite des études structurales des partenaires impliquées, afin de comprendre le mécanisme de reconnaissance par le T2SS.
L’objectif du projet est de comprendre comment le T2SS, une nano-machine multiprotéique complexe, transporte des protéines repliées à travers la membrane externe. Ce projet est axé sur le problème de la reconnaissance des exoprotéines par les T2SS : quel est le signal de sécrétion et comment la reconnaissance et la sécrétion des exoprotéines s’effectuent elles ?
Un aspect innovant de notre projet est l’utilisation d’une approche interdisciplinaire qui nous donnera des réponses du niveau cellulaire au niveau moléculaire. Pour effectuer ce travail, nous tirerons avantage de nos expertises complémentaires dans un grand nombre de méthodes allant de la biochimie, la génétique, la microbiologie à la modélisation in silico, la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN. En effet, si l’analyse structurale in silico des protéines sécrétées par des T2SS est une méthode très performante pour identifier des signaux de sécrétion potentiels, elle ne peut pas à elle seule fournir des informations fonctionnelles. D’autre part l’identification de signaux de sécrétion par des approches biochimiques et génétiques nécessite une expertise structurale forte. Une autre originalité de notre projet est l’utilisation de deux modèles bactériens (E. chrysanthemi et K. oxytoca) et d’un panel de protéines sécrétées. Une douzaine de protéines solubles sont sécrétées par le système Out d’E. chrysanthemi, alors que le substrat du système Pul est une lipoprotéine de la membrane externe. Les approches techniques complémentaires utilisées par chaque partenaire et appliquées à différents modèles permettront d’obtenir des informations communes à tous les systèmes.
Une meilleure compréhension des mécanismes de sécrétion par le T2SS et la détermination de la base moléculaire de la spécificité de la sécrétion va non seulement élargir nos connaissances, mais aussi ouvrir une voie à l’élaboration de nouveaux agents anti-bactériens. Ce projet pourrait aider à la conception de petites molécules qui, en interagissant avec les signaux de sécrétion ou les composants des T2SS, vont bloquer la sécrétion. Ces composés pourraient être une alternative aux antibiotiques pour lutter contre les bactéries pathogènes. Ces résultats pourraient aussi être utilisés pour obtenir la sécrétion de protéines hétérologues d’intérêt biotechnologique par des T2SS, en modifiant la surface des protéines sans affecter leur activité biologique. L’identification des signaux de sécrétion permettra d’utiliser une stratégie rationnelle en vue de ces applications.

Coordinateur du projet

CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-AUVERGNE (Divers public)

L'auteur de ce résumé est le coordinateur du projet, qui est responsable du contenu de ce résumé. L'ANR décline par conséquent toute responsabilité quant à son contenu.

Partenaire

CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-AUVERGNE
INSTITUT PASTEUR
CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE - DELEGATION REGIONALE RHONE-AUVERGNE

Aide de l'ANR 339 593 euros
Début et durée du projet scientifique : - 36 Mois

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